NanoWiki - Brukerbidrag [nb]

X-Ray Photon Spectroscopy

2009-05-26T18:54:29Z

Ingrhal:

Kvalitativ analyse av sekundære elektroner som kommer fra prøven når man sender røntgenstråling på. Røntgenstrålene absorberes av atomene, og fører til at elektroner blir "dyttet" ut av prøven. Energien elektronene kommer ut med er avhengig av den initielle bindingsenergien og energien til røntgenstrålene. XPS er dermed sensitiv til ikke bare den kjemiske sammensetningen, men også til bindingsstrukturen. De sekundære elektronene kommer fra bare noen få atomlag under overflaten, XPS er dermed ekstremt sensitiv til kjemiske forandringer på overflaten. Siden røntgenstråler ikke kan fokuseres får man ingen romlig oppløsning ved XPS.

Siden dette er en overflateteknikk må prøven være fri for forurensing. XPS må altså gjøres i ultrahøyt vakuum (<math>10^{-8} Torr</math>). Prøven er som regel "rensket" med sputtering først.

Denne metoden er brukt for studier på gas absorpsjon eller katalyse med monolag.

[[Kategori: Teknikker i tools]]

Auger Electron Spectroscopy

2009-05-26T18:54:05Z

Ingrhal:

Bruker elektroner eller røntgenstråling inn på prøven, og får ut Auger elektroner. Ganske lik teknikk som [[XPS]], ved ekstrem sensitivitet til bare et par atomlag på prøven, men har i tillegg romlig oppløsning siden elektronstråling kan bli brukt. Auger elektroner genereres ved at den initielle strålen "dytter" ut et elektron fra et atom. For å fylle hullet fra dette elektronet, vil et elektron fra et høyere nivå, slippe seg ned og dermed miste litt energi. Denne energien blir absorbert i et elektron i valensbåndet, som dermed kan "hoppe" ut. Energien til et Auger-elektron er altså bestemt av tre energier avhengig av eksitasjons nivåene i atomet. Som vi ser vil Auger elektronene konkurrerer med karakteristisk røngtgenstråling! Energi absorpsjons"edges" brukt i [[EELS]] avhenger dermed av både Auger og den karakteristiske røntgenstrålingen, der Auger dominerer ved lave atomnummer. Styrken til Auger spektroskopi er dermed sensitiviteten til forandringer i den kjemiske konsentrasjonen på overflaten til atomer med lavt atom nummer.

Som sagt er dybdeoppløsningen gitt ved et par atomlag. Den romlige oppløsningen er gitt av den initielle strålen, slik som i [[SEM]] og [[STEM]]. Ved høyere atomnummer blir oppløsningen dårligere pga augerelektroner generert av backscattered elektroner. Den avgrensende faktoren i Augerbilder er lav signal intensitet.

Forurensing er et stort problem, og AES må dermed foregå i ultrahøyt vakuum.

Spektrumet er har ofte mye bakgrunnstøy pga sekundære elektroner. Det er derfor vanlig å vise et differentiert spektrum. Posisjonen blir dermed definert ved null, og bredden er distansen mellom minimum og maksimum. Kjemiske bindinger viser seg på to måter i spekteret: enten ved et energiskift i hovedtoppen, eller en forandring i energistrukturen på den lavere energisiden av hovedtoppen.

Når man avbilder Augerelektroner får man samme skyggeeffekt som vi ser i [[SEM]].

[[Kategori:Teknikker i tools]]

Analytisk elektron mikroskopi

2009-05-26T18:53:47Z

Ingrhal:

Bruker karakteristisk røntgen-stråling fra uelastiske kollisjoner til å finne den kjemiske sammensetningen i prøven. Kan brukes både kvalitativt (de kjemiske stoffene) og kvantitativt (sammenhengen mellom mikrostrukturen og de kjemiske stoffene). De karakteristiske røntgen-strålene kan velges ut fra det observerte spektrum enten pga energi eller bølgelengde. Det primære målet for disse metodene er å finne sammensetningen i bulk (selv om det bare er snakk om volumelelement på mikrometer-nivå), ikke på overflaten. Både [[SEM]] og [[TEM]] kan brukes med disse teknikkene.

== Energy dispersive Spectrometry - EDS==
*Enkel å bruke
*Har død-tid, altså en minimums tid mellom hver gang et foton registreres
*Relativ dårlig energi-oppløsning, spesielt ved lav-energistråling (lang bølglengde).
*Deteksjon av lav-energifotoner er vanskelig. Absorpsjonen er svært høy både i prøven og detektoren.
*Problemer med overlappende topper fra forskjellige elementer og "escape" peaks, altså topper pga fluorescence.
*Dårligere romlig nøyaktighet i forhold til WDS

== Wavelength dispersive Spectrometry - WDS==
*Mye bedre oppløsning enn EDS
*Avhengig av hvordan detektoren er satt, er den mer sensitiv i en retning enn en annen.
*Svært sakte

== Kvantitativ analyse==
Før analysen kan begynne må man rette for bakgrunnsstrålingen, "escape" topper og overlappende topper. Man må dermed bruke en iterativ metode for å finne konsentrasjonene. Man korrigerer for F-fluorescence, A-absorpsjon og Z-atomnummer i den rekkefølgen.
Iterasjonprosessen er basert på:
<math>\frac{C_a}{C_b}=K \frac{I_a}{I_b}=</math> der C er konsentrasjonen, I er intensiteten, K er en nøyaktighetsfaktor, A er den ukjente prøven og B er en standard prøve.

==Nøyaktighet og Oppløsning==
*Detection limit: 0.5 atom %
*Feilen i den kvantitative analysen: 2% av den målte konsentrasjonen
*Den romlige oppløsningen avhenger av den initielle strålingsenergien. En høyere strålingsenergi vil gi et større volum der røntgen kan genereres, men gir også flere røntgenstråler og dermed bedre deteksjonsmuligheter. Det mest optimale er å ha en intiell strålingsenergi som ligger mellom 3 og 4 ganger eksitasjonenergien til den karakteristiske linjen med høyest energi.

== I TEM==
Siden prøven er såpass tynn og den initielle energien såpass høy, vil røntgensignalet være mye svakere og veldig få røntgenstråler vil bli generert, men den romlige oppløsningen er mye bedre i TEM enn i SEM. I TEM er det viktig å passe på:
*Den høye bakgrunnstøyen pga stråling fra mikroskopet
*Detektor nærme prøven for maksimering av detektering
*Avhengigheten av tykkelsen
*Det finnes ingen flourescence-effekter
Å bruke en [[STEM]] er enda bedre, da den romlige oppløsningen er enda bedre, og man kan lage et element kart, samtidig som man lager bilder ved å bruke [[bright-field STEM]], [[HAADF]], som kan synkroniserers.

For å få bedre oppløsning, og bedre analyser av lav-energistråling kan man bruke [[EELS]] eller [[EFTEM]]

[[Kategori: Teknikker i tools]]

Auger Electron Spectroscopy

2009-05-26T18:52:19Z

Ingrhal: Ny side: Bruker elektroner eller røntgenstråling inn på prøven, og får ut Auger elektroner. Ganske lik teknikk som XPS, ved ekstrem sensitivitet til bare et par atomlag på prøven, men har...

X-Ray Photon Spectroscopy

2009-05-26T18:25:02Z

Ingrhal:

Kvalitativ analyse av sekundære elektroner som kommer fra prøven når man sender røntgenstråling på. Røntgenstrålene absorberes av atomene, og fører til at elektroner blir "dyttet" ut av prøven. Energien elektronene kommer ut med er avhengig av den initielle bindingsenergien og energien til røntgenstrålene. XPS er dermed sensitiv til ikke bare den kjemiske sammensetningen, men også til bindingsstrukturen. De sekundære elektronene kommer fra bare noen få atomlag under overflaten, XPS er dermed ekstremt sensitiv til kjemiske forandringer på overflaten. Siden røntgenstråler ikke kan fokuseres får man ingen romlig oppløsning ved XPS.

Siden dette er en overflateteknikk må prøven være fri for forurensing. XPS må altså gjøres i ultrahøyt vakuum (<math>10^{-8} Torr</math>). Prøven er som regel "rensket" med sputtering først.

Denne metoden er brukt for å teste de fleste av energinivåene i atomer som blir funnet i eletronenergitapspektroskopi ([[EELS]]), og for studier på gas absorpsjon eller katalyse med monolag.

[[Kategori: Teknikker i Tools]]

Atomic Force Microscopy

2009-05-26T15:06:27Z

Ingrhal: /* Modes of operation */

==Short facts==
*High vacuum is not necessary.
*Piezoelectric position control system.
*The cantilever: V-shaped or single beam. V-shaped: high deflection sensitivity, not sensitive to torque. Single beam: vice-versa.
*Tip materials used: diamond, tungsten, silicon. Silicon nitride - high elastic rigidity.
*Artifacts: drift, non-linear hysteresis of piezoelectric.

==Basic setup and components==

*AFM often mounted on rigid base with high damping capacity.
*Adjustable sample stage.
*

Movement:
*X-Y: Applying voltage of opposite signs across diagonal segments of piezoelectric tube. Will cause it to bend.
*Z: Apply voltage on tube that contracts or expands axial length.

Split photo detector:

*Solid state laser
*The deflected cantilever reflects a laser beam from two points on the cantilever (before and after deflection) and two beams are sent to the detector. The signal generated depends on the proporiton of light falling on each half of the photodiode. (Noen som kan forklare dette bedre?)
*Can also measure phase shifts.

Data collection:

*Artifacts! Non-linearity in piezoelectric response. Sample surface must be coplanar with x-y scan of probe tip.

==Modes of operation==
It is the displacement of the probe tip at the end of the cantilever that is measured. The modes use different tips, and therefore have different resolutions. Problem and material determines which mode is used.

Interaction model (surface forces) lies behind different modes:
*Strongly affected by surface adsorbates and gaseous/liquid environment.

===Contact mode===
In the contact region of the potential energy curve, repulsive forces dominate. The tip most commonly used is silicion nitrid, because of its physical restitance to damage. The radii is about 20-60nm, and atomic resolution is therefore beyond reach.

Two sub-modes:
*Set height constant and measure repulsive force.
*Set repulsive force constant and measure height.

Artifacts that can be removed when operating in contact mode:
*Capilliary attraction from films of moisture (under atmospheric conditions).
*Electrostatic charging of surface

===Tapping mode===
In the semi-contact region of the potential energy curve. Attractive and repulsive forces have similar magnitude. Force on probe tip changes sign during cycle. The tip used is usually a silicon tip with radii in the order of 10nm, which result in a very high resolution. Phase image extremly sensitive to elastic properties.

===Non-contact mode===
In the non-contact region of the potential energy curve, attractive forces dominate and are measured. What is observed is a an increase in the amplitude of the oscillations of the vibrating probe, translated into a change in attractive forces.

Maximum deflection sensitivity: Thin v-shaped cantilever. Si nitride tip minimizes damage to the tip. Soft samples: Constant pre-set cantilever deflection. (Kan noen utdype/omformulere siste setning?)

[[Kategori: teknikker i tools]]

Transmission Electron Microscopy

2009-05-26T13:33:38Z

Ingrhal:

Dette er et av to typer elektronmikroskop. Med en TEM får man god oppløsning, omtrent ned på atomært nivå. Denne saken sender elektroner ned gjennom et rør som innehar en del elektromagnetiske linser som får alt til å bli bra. Det er flere forskjellige ting man kan få ut av og gjøre med en TEM og noen forskjellige saker står derfor under. Den viktikste egenskapen til en TEM er at den kombinerer informasjon fra både det virkelige rom (real space) og det resiproke rom (reciprocal space).

== Oppsett ==
Kilden er en elektronkanon med en svært høy spenning (100-400kV). Elektronkanonen kan være av forskjellige typer (filamenter eller "tip"er), men det mest vanlige materialet er Wolfram (Tungsten). Elektronene blir så akselrert av en anode holdt ved jord. Strålen er karakteristert av den effektive størrelsen, vinkelen, elektronenergien og spredningen av elektronenergier. En liten effektiv størrelse forbedrer strålens koherens.

"Condenser" aperturen er elektromagnetiske linser som fokuserer elektronstrålen. De har samme funksjon som condenser aperturen i [[optiske mikropskop]]. Forskjellen er at man her kan variere fokal lengden, ved å variere strømmen som går i linsene. Elektronene vil følge en heliks bane pga det elektromagnetsike feltet.

Prøvematerialet kan både roteres og vippes. Diameteren på prøven må være under 3mm, og tykkelsen må være under 0.1 <math>\mu m</math>, for å få elastisk spredning (scattering).

Bildet blir laget av en "flourescent" skjerm som konverterer høy-energi-elektronbildet til et bildet vi kan se, eller ved et CCD-kamera.

== Oppløsning ==
Ved 100kV er oppløsningen ca. 0.2nm.

De "vanlige" ligningen for depth of field and focus fra optisk mikroskopi, kan ikke lenger brukes med sikkerhet, nå som linsene ikke lenger kan defineres som "tynne" linser. Man kan likevel finne approksimerte verdier. Depht of field blir dermed 20-200nm (noe som avgrenser tykkelsen til en prøve enda mer), mens depth of focus blir flere meter!

Begrensninger på oppløsningen er gitt ved Rayleighs kriterium som for [[optisk mikroskopi]]. Man kan altså få høyere oppløsning ved høyere spenning, men en spenning opp mot 1MV vil som regel skade prøven. Man får analogt med optisk mikroskopi også sfæriske og kromatiske avik (spherical and cromatic aberrations). Sfæriske avik kommer fra at stråler i forskjellig avstand fra den optiske aksen (forskjellig vinkel) vil fokuseres ved forskjellige fokal punkt. Der en stråle lengre unna aksen vil fokuseres på et punkt nærmere linsen. Kromatiske avik kommer fra at stråler med forskjellig energi vil fokuserers ved forskjellige fokalpunkt. En stråle med høyere energi vil fokuseres på et punkt nærmere linsen.

Astigmatisme kommer fra manglende aksial symmetri ved objektiv linsene, noe som også fører til en usikkerhet i fokalpunktet. Dette kan som regel korrigeres ved magnetiske felt.

== Kontrast ==
*Mass-thickness contrast: Sannsynligheten for at et elektron blir spredd elastisk avhenger av spredningsfaktoren (atomic scattering factor), som øker med atom nummeret og det totale antall atomer. Spredningen er altså avhengig av prøvens tykkelse og tetthet, noe som gir kontrast i bildet. Amorfe og biologiske prøver vil dominerers at mass-thickness contrast.

*Diffraction contrast: Denne typen kontrast kommer fra avik i enten den eksakte betingelsen fra Braggs lov eller avik i krystallstrukturen. Det er altså både avik i det virkelige rom og i det resiproke rom som fører til kontrast. I krystallinske materialer er dette den dominate kontrasten.

*Phase contrast: I TEM kan man velge hvilke ståler man vil se på (en spredd stråle, eller den direkte strålen). For å få phase contrast må man sette aperturen slik at man velger flere stråler samtidig. Det vil dermed oppstå et interferensmønster ut i fra disse strålene pga en veiforskjell. Dette interferensmønsteret gir kontrast. Ved phase-contrast vil oppløsningen kunne bli mye bedre enn ved mass-thickness eller diffraction, helt ned til 0.07nm.

== Teknikker ==
I TEM bruker man objektivaperturen til å bestemme hvilke(n) stråle(r) man vil se på. Dette fører til mange forskjellige teknikker og kontraster.

=== Bright-field - BF ===
Her brukes den direkte elektronstrålen som har gått rett gjennom prøven. Bakgrunnen blir dermed lys, sånn som i optisk mikroskopi. Denne teknikken bruker mass-thickness contrast.

=== Dark-field DF ===
Her brukes en spredd stråle, og analogt med optisk mikroskopi får man svart bakgrunn og bedre kontrast enn ved bright field. Denne teknikken bruker diffraction contrast. Dersom "incident beam" er rett og man velger en spredd stråle får man det man kaller dirty DF, eller lav-oppløsnings DF. Dersom man heller tilter strålen og velger strålen langs den opprinnelige optiske aksen får man høy-oppløsnings DF.

=== High Resolution - HREM ===
Bruker en kombinasjon av DF og BF, altså den velger flere stråler, og bruker phase contrast. Bildet man får er i meget høy oppløsning, men kan være vanskelig å tolke pga mange interferensfenomener.

Høy oppløsning. HØY!

=== Electron Energy-Loss Spectroscopy - EELS ===
Hvis man fjerner den vanlige detektoren i en TEM, og i stedet lar elektronene passere igjennom et magnetisk prisme slik at de blir avbøyd på grunn av [[Lorentz-kraften]], vil man kunne filtrere elektronene etter energi. Dette fordi elektroner med høy energi, og dermed høy hastighet, vil kreve en lengre distanse til å bli avbøyd 90 grader enn elektroner som går saktere. Konsekvensen blir dermed at man får skilt ut elektronene i rommet basert på deres energi, på samme måte som man kan spre lys til et spekter vha. et optisk prisme.

Slik energiatskillelse er interessant siden elektroner som blir sendt gjennom en prøve i mange tilfeller vil tape litt energi. Energien elektronene taper skyldes vekselvirkninger med materialet i prøven, og energien elektronene taper vil dermed være karakteristisk for materialet det passerer igjennom.

EELS brukes til analytisk mikroskopi, og er spesielt egnet til deteksjon av lettere atomer, pga den høye deteksjons-effektiviteten og den gode oppløsningen. Energioppløsningen til EELS er rundt 0.1 eV, den romlige oppløsningen er 0.5nm og den analytiske nøyaktigheten er rundt hundre atomer. Dette er mye bedre enn andre analytiske metoder som [[EDS]] og [[WDS]].

=== Energy Filtered TEM - EFTEM ===
Gitt et oppsett som ved [[EELS]], vil man etter det magnetiske prismet ha signalet spredd i rommet etter elektronenergi, og signalet vil være i [[resiprokt rom]]. Dette vil si at i et hvert "energibånd" (høydeutsnitt), vil ha et komplett romlig bilde av prøven. Hvis man da bruker et apertur til å kun velge seg ut elektroner med en viss energi, og konverterer signalet tilbake til reelt rom, vil man få et bildet av ''hvor i prøven elektroner med en viss energi kommer i fra''. Da forskjellige materialer gjerne gir større energitap for elektronene som passerer, vil man kunne bruke EFTEM til å lokalisere spesifikke materialer i prøven. Denne "filtreringen" fører til mye bedre kontrast, enn ved vanlige diffraksjonbilder, og kan gi mye bedre bilder av atomer med lignende atomnummer.

=== Scanning TEM - STEM===
Fokuserer strålen slik at man kan scanne bildet, i stedet for å få informasjonen simultant. STEM har alle de samme funksjonene som vanlig TEM, og man kan dermed få bright field, dark field, HAADF osv. I HAADF får man nå noe som kalles z-contrast, altså en direkte sammenheng mellom den lokale kontrasten og mass-thickness kontrasten som avhenger av atom nummeret (Z).

=== High Angle Annular Dark Field - HAADF===
Kommer av elektroner som blir avbøyd kraftig av tunge atom-kjerner (Z-kontrast). HAADF er altså avhengig av størrelsen på atomene og ikke strukturen til latticen, som vanlig DF er. Brukes kun i sammenheng med STEM (har ikke funnet noen eksempler på HAADF-TEM, kun HAADF-STEM).

[[Kategori: teknikker i tools]]

Transmission Electron Microscopy

2009-05-26T13:20:06Z

Ingrhal: /* Electron Energy-Loss Spectroscopy */

Dette er et av to typer elektronmikroskop. Med en TEM får man god oppløsning, omtrent ned på atomært nivå. Denne saken sender elektroner ned gjennom et rør som innehar en del elektromagnetiske linser som får alt til å bli bra. Det er flere forskjellige ting man kan få ut av og gjøre med en TEM og noen forskjellige saker står derfor under. Den viktikste egenskapen til en TEM er at den kombinerer informasjon fra både det virkelige rom (real space) og det resiproke rom (reciprocal space).

== Oppsett ==
Kilden er en elektronkanon med en svært høy spenning (100-400kV). Elektronkanonen kan være av forskjellige typer (filamenter eller "tip"er), men det mest vanlige materialet er Wolfram (Tungsten). Elektronene blir så akselrert av en anode holdt ved jord. Strålen er karakteristert av den effektive størrelsen, vinkelen, elektronenergien og spredningen av elektronenergier. En liten effektiv størrelse forbedrer strålens koherens.

"Condenser" aperturen er elektromagnetiske linser som fokuserer elektronstrålen. De har samme funksjon som condenser aperturen i [[optiske mikropskop]]. Forskjellen er at man her kan variere fokal lengden, ved å variere strømmen som går i linsene. Elektronene vil følge en heliks bane pga det elektromagnetsike feltet.

Prøvematerialet kan både roteres og vippes. Diameteren på prøven må være under 3mm, og tykkelsen må være under 0.1 <math>\mu m</math>, for å få elastisk spredning (scattering).

Bildet blir laget av en "flourescent" skjerm som konverterer høy-energi-elektronbildet til et bildet vi kan se, eller ved et CCD-kamera.

== Oppløsning ==
Ved 100kV er oppløsningen ca. 0.2nm.

De "vanlige" ligningen for depth of field and focus fra optisk mikroskopi, kan ikke lenger brukes med sikkerhet, nå som linsene ikke lenger kan defineres som "tynne" linser. Man kan likevel finne approksimerte verdier. Depht of field blir dermed 20-200nm (noe som avgrenser tykkelsen til en prøve enda mer), mens depth of focus blir flere meter!

Begrensninger på oppløsningen er gitt ved Rayleighs kriterium som for [[optisk mikroskopi]]. Man kan altså få høyere oppløsning ved høyere spenning, men en spenning opp mot 1MV vil som regel skade prøven. Man får analogt med optisk mikroskopi også sfæriske og kromatiske avik (spherical and cromatic aberrations). Sfæriske avik kommer fra at stråler i forskjellig avstand fra den optiske aksen (forskjellig vinkel) vil fokuseres ved forskjellige fokal punkt. Der en stråle lengre unna aksen vil fokuseres på et punkt nærmere linsen. Kromatiske avik kommer fra at stråler med forskjellig energi vil fokuserers ved forskjellige fokalpunkt. En stråle med høyere energi vil fokuseres på et punkt nærmere linsen.

Astigmatisme kommer fra manglende aksial symmetri ved objektiv linsene, noe som også fører til en usikkerhet i fokalpunktet. Dette kan som regel korrigeres ved magnetiske felt.

== Kontrast ==
*Mass-thickness contrast: Sannsynligheten for at et elektron blir spredd elastisk avhenger av spredningsfaktoren (atomic scattering factor), som øker med atom nummeret og det totale antall atomer. Spredningen er altså avhengig av prøvens tykkelse og tetthet, noe som gir kontrast i bildet. Amorfe og biologiske prøver vil dominerers at mass-thickness contrast.

*Diffraction contrast: Denne typen kontrast kommer fra avik i enten den eksakte betingelsen fra Braggs lov eller avik i krystallstrukturen. Det er altså både avik i det virkelige rom og i det resiproke rom som fører til kontrast. I krystallinske materialer er dette den dominate kontrasten.

*Phase contrast: I TEM kan man velge hvilke ståler man vil se på (en spredd stråle, eller den direkte strålen). For å få phase contrast må man sette aperturen slik at man velger flere stråler samtidig. Det vil dermed oppstå et interferensmønster ut i fra disse strålene pga en veiforskjell. Dette interferensmønsteret gir kontrast. Ved phase-contrast vil oppløsningen kunne bli mye bedre enn ved mass-thickness eller diffraction, helt ned til 0.07nm.

== Teknikker ==
I TEM bruker man objektivaperturen til å bestemme hvilke(n) stråle(r) man vil se på. Dette fører til mange forskjellige teknikker og kontraster.

=== Bright field ===
Her brukes den direkte elektronstrålen som har gått rett gjennom prøven. Bakgrunnen blir dermed lys, sånn som i optisk mikroskopi. Denne teknikken bruker mass-thickness contrast.

=== Dark field ===
Her brukes en spredd stråle, og analogt med optisk mikroskopi får man svart bakgrunn og bedre kontrast enn ved bright field. Denne teknikken bruker diffraction contrast. Dersom "incident beam" er rett og man velger en spredd stråle får man det man kaller dirty DF, eller lav-oppløsnings DF. Dersom man heller tilter strålen og velger strålen langs den opprinnelige optiske aksen får man høy-oppløsnings DF.

=== High Resolution TEM ===
Bruker en kombinasjon av DF og BF, altså den velger flere stråler, og bruker phase contrast. Bildet man får er i meget høy oppløsning, men kan være vanskelig å tolke pga mange interferensfenomener.

Høy oppløsning. HØY!

=== High Angle Annular Dark Field ===
Kommer av elektroner som blir avbøyd kraftig av tunge atom-kjerner (Z-kontrast). HAADF er altså avhengig av størrelsen på atomene og ikke strukturen til latticen, som vanlig DF er. Brukes kun i sammenheng med STEM (har ikke funnet noen eksempler på HAADF-TEM, kun HAADF-STEM).

=== Electron Energy-Loss Spectroscopy - EELS ===
Hvis man fjerner den vanlige detektoren i en TEM, og i stedet lar elektronene passere igjennom et magnetisk prisme slik at de blir avbøyd på grunn av [[Lorentz-kraften]], vil man kunne filtrere elektronene etter energi. Dette fordi elektroner med høy energi, og dermed høy hastighet, vil kreve en lengre distanse til å bli avbøyd 90 grader enn elektroner som går saktere. Konsekvensen blir dermed at man får skilt ut elektronene i rommet basert på deres energi, på samme måte som man kan spre lys til et spekter vha. et optisk prisme.

Slik energiatskillelse er interessant siden elektroner som blir sendt gjennom en prøve i mange tilfeller vil tape litt energi. Energien elektronene taper skyldes vekselvirkninger med materialet i prøven, og energien elektronene taper vil dermed være karakteristisk for materialet det passerer igjennom.

=== Energy Filtered TEM ===
Gitt et oppsett som ved [[EELS]], vil man etter det magnetiske prismet ha signalet spredd i rommet etter elektronenergi, og signalet vil være i [[resiprokt rom]]. Dette vil si at i et hvert "energibånd" (høydeutsnitt), vil ha et komplett romlig bilde av prøven. Hvis man da bruker et apertur til å kun velge seg ut elektroner med en viss energi, og konverterer signalet tilbake til reelt rom, vil man få et bildet av ''hvor i prøven elektroner med en viss energi kommer i fra''. Da forskjellige materialer gjerne gir større energitap for elektronene som passerer, vil man kunne bruke EFTEM til å lokalisere spesifikke materialer i prøven.

=== Scanning TEM ===
Fokuserer strålen slik at man kan scanne bildet, i stedet for å få informasjonen simultant. STEM har alle de samme funksjonene som vanlig TEM, og man kan dermed få bright field, dark field, HAADF osv. I HAADF får man nå noe som kalles z-contrast, altså en direkte sammenheng mellom den lokale kontrasten og mass-thickness kontrasten som avhenger av atom nummeret (Z).

[[Kategori: teknikker i tools]]

Analytisk elektron mikroskopi

2009-05-26T13:19:02Z

Ingrhal:

Analytisk elektron mikroskopi

2009-05-26T12:52:56Z

Ingrhal: Ny side: Bruker karakteristisk røntgen-stråling fra uelastiske kollisjoner til å finne den kjemiske sammensetningen i prøven. Kan brukes både kvalitativt (de kjemiske stoffene) og kvantitativt ...

Optisk mikroskopi

2009-05-25T15:40:36Z

Ingrhal:

== Oppsett ==
Består av en kilde (lyspære), "condenser" linser og aperturer, objektivlinser og aperturer og et kamera. Condenser linsen fokuserer lyset til et fokal punkt - back focal plane, mens aperturen begrenser mengden lys. Ved å sette aperturen til at bare litt lys kommer inn øker man kontrasten, men intensiteten minker. Objektivlinsen bestemmer forstørrelsen og er avhenging av den numeriske aperturen (NA). For å øke lysstyrken kan man øke NA, men dette vil samtidig føre til en kortere "working distance".

== Oppløsning, forstørring og kontrast==
Oppløsning er gitt av Rayleighs kriterium:
<math>r=0.61\frac{\lambda}{\mu sin \alpha}</math>
der <math>\lambda</math> er bølgelengden, <math>\mu</math> er brytningsindeksen og <math>\alpha</math> er halve aperturevinkelen. <math>\mu sin \alpha</math> er gitt som den numeriske aperturen NA, som kan stilles inn på mikroskopet.
Oppløsningen er definert som den minste avstand man kan skille to punkter. Oppløsningen kan økes ved å minimerer bølgelengden eller maksimere den numeriske aperturen.

Forstørring er definert som <math>M=\frac{u}{v}</math> der u er størrelsen på bilde og v er størrelsen på objektet.

Kontrast er definert som <math>C= \frac{I_{feature}- I_{background}}{I_{background}}</math>

Depth of field er dybden man fremdeles har objektet i fokus og er gitt ved: <math>d=r tan \alpha</math>. Økende NA (økende kontrast) gir dermed mindre depth of field.

Depht of focus er dybden man fremedeles har bildet i fokus, og er gitt ved:<math>D=M^2d</math> der M er forstørrelsen og d er depth of field.

Avik i oppløsningen er gitt ved sfæriske og kromatiske avik (spherical and cromatic aberrations). Sfæriske avik kommer fra at stråler i forskjellig avstand fra den optiske aksen (forskjellig vinkel) vil fokuseres ved forskjellige fokal punkt. Der en stråle lengre unna aksen vil fokuseres på et punkt nærmere linsen. Kromatiske avik kommer fra at stråler med forskjellig bølgelengde vil fokuserers ved forskjellige fokalpunkt. En stråle med mindre bølgelengde vil fokuseres på et punkt nærmere linsen. Kromatisk avvik kan forsvinne ved bruk av monokromatisk lys.

Astigmatisme kommer fra manglende aksial symmetri ved objektiv linsene, noe som også fører til en usikkerhet i fokalpunktet. Dette kan som regel korrigeres ved å justere linsene.

==Teknikker==
===Bright field===
Bruker lys normalt på prøven, reflektert lys blir dermed lyse felt, mens spredd lys vil spres utenfor linsa, og opptre som mørke felt.
===Dark field===
Setter for en aperture slik at lyset kommer på skrått inn mot prøven. Nå blir altså spredd lys til hvite felt, og reflekterlys til mørke felt. Dark field har større kontrast pga at bakgrunnen er mørk (intensiteten er null).
===Phase contrast===
Bruker her at en høydeforskjell i prøven gir en forskjellig veilengde for lyset, og dermed forskjellig fase. Denne forskjellen i fase brukes til å lage kontrast. For å måle forskjellen brukes en faseplate som skifter lyset enda mer. Denne kontrasten er svært god for prøver med lik brytningsindeks som bakgrunnen, for eksempel biologiske prøver.

[[Kategori: teknikker i tools]]

Scanning Electron Microscopy

2009-05-25T15:40:07Z

Ingrhal:

Vil du se mer enn det du ser i et optisk mikroskop, men ikke trenger atomær oppløsning? Da er SEM svaret. Et elektronmiksroskop der man kan sender inn en elektronstråle på noen tusen elektronvolt og får ut sekundære elektroner (SE, secondary electrons), tilbakespredte elektroner (BSE, backscattered electrons), røntgenstråler og mye mer.

== Oppsett ==
Fungerer som et slags opp-ned TEM-mikroskop. Elektronkanon sitter der bildet sitter i TEM, objektivlinsen blir dermed probelinsen, og fungerer ved å minimere elektronstrålen.

== Parmetere==
*Probe størrelse: En mer fokusert stråle, gir mindre intensitet.
*Working distance: En lengre WD, gir bedre depth of field.
*Aperture størrelse: En mindre aperture størrelse, gir bedre depth of field.
Best depth of field: lang WD, liten aperture størrelse
Best kontrast: kort WD, stor aperture størrelse

== Teknikker ==

=== SE ===
Sekundære elektroner (SE) er elektroner som blir "dyttet" ut av prøven av den initielle elektronstrålen. Disse kan igjen samles i to grupper: de elektronene som blir dyttet ut av elektroner fra elektronstrålen, og de som blir dyttet ut av backscattered elektroner som har returnert til overflaten etter flere uelastiske kollisjoner. Den første gruppen kommer fra overflaten (1-20nm), og oppløsningen er bare bestemt av diameteren på proben. SE har mye lavere energi (10-50eV) enn den initielle elektronstrålen, og er den gruppen av elektroner som gir høyest utbytte fra prøven. Siden de har såpass lave energier kan de lett bli samlet av en lav biasspenning. For å skille mellom SE fra elektronstrålen og de fra backscattered elektroner, har man satt en detektor rett ovenfor prøven, inne i det magnetiske feltet. SE fra elektronstrålen kommer fra overflaten rett under proben, og vil dermed fly opp i denne detektoren. SE fra backscattered kommer med større vinkel, og vil ikke treffe denne detektoren.

Faktorer som påvirker de sekundære elektronene er
*"Work function" til prøven, altså hvor lett det er for elektronene å komme ut. Jo lettere det er å komme ut, jo flere sekundære elektroner får man.
*Den initielle elektronstråle-energien. En høy energi fører til at strålen blir ført lengre ned i prøven, og dermed reduserer ant. sekundære elektroner. Men en lav energi fører til en lavere strøm i den initielle strålen, og dermed en lavere strøm av sekundære elektroner.
*Tettheten til prøven. Ved høyere atomnummer (Z) øker ant. sekundære elektroner.
*Topografi, en endring i overflaten gir en endring i hvor lett det er å komme seg ut. En region med en "dal" minker ant. elektroner, mens en region med en "ås" øker ant. elektroner.

Kontrast kommer enten fra variasjoner i atomnummer eller variasjoner i overflatetopografien. Den økende utstrålingen ved "åser" i topografien vil ofte være større enn den reelle åsen, og det samme vil skje ved daler. Dette fører til at bildet vi ser ligner på et skyggelagt bilde, og gir 3Dfølelse.

=== BSE ===
Backscattered elektroner er elektroner fra den initielle elektronstrålen som inngår i uelastiske kollisjoner og dermed blir sendt ut av prøven igjen.

Kontrast er gitt av:
*Atomnummer - mengden BSE er avhengig av atomnummeret i prøven, og øker med økende Z.
*Topografi - regioner som er vippet i forhold til BSE-detektoren, vil gi et bedre signal, enn regioner som er vippet andre veien. Segmentdetektorer vil gi topografikontrast en fordel i forhold til atomnummerkontrast.

Oppløsning:
Ikke like bra som ved SE, da volumet BSE kommer fra spiller en rolle. Vanligvis ned mot 50nm ved strålingsenergier på 10-20keV.

Kan også brukes til å finne crystallstrukturen, ved å lage EBSD, lignende som Kichuchi-mønster.

===EDS===
Energy-dispersive spectrometry. Røntgenmetode. Sjekker ut hva slags materiale(r) du har i prøva. Kan lage -punkt, -linje eller EDS-kart. EDS-kart: Bruker lang tid, dårlig oppløsning.
Ofte et problem at flere topper adderes sammen.

[[Kategori: teknikker i tools]]

Transmission Electron Microscopy

2009-05-25T15:39:45Z

Ingrhal:

Dette er et av to typer elektronmikroskop. Med en TEM får man god oppløsning, omtrent ned på atomært nivå. Denne saken sender elektroner ned gjennom et rør som innehar en del elektromagnetiske linser som får alt til å bli bra. Det er flere forskjellige ting man kan få ut av og gjøre med en TEM og noen forskjellige saker står derfor under. Den viktikste egenskapen til en TEM er at den kombinerer informasjon fra både det virkelige rom (real space) og det resiproke rom (reciprocal space).

== Oppsett ==
Kilden er en elektronkanon med en svært høy spenning (100-400kV). Elektronkanonen kan være av forskjellige typer (filamenter eller "tip"er), men det mest vanlige materialet er Wolfram (Tungsten). Elektronene blir så akselrert av en anode holdt ved jord. Strålen er karakteristert av den effektive størrelsen, vinkelen, elektronenergien og spredningen av elektronenergier. En liten effektiv størrelse forbedrer strålens koherens.

"Condenser" aperturen er elektromagnetiske linser som fokuserer elektronstrålen. De har samme funksjon som condenser aperturen i [[optiske mikropskop]]. Forskjellen er at man her kan variere fokal lengden, ved å variere strømmen som går i linsene. Elektronene vil følge en heliks bane pga det elektromagnetsike feltet.

Prøvematerialet kan både roteres og vippes. Diameteren på prøven må være under 3mm, og tykkelsen må være under 0.1 <math>\mu m</math>, for å få elastisk spredning (scattering).

Bildet blir laget av en "flourescent" skjerm som konverterer høy-energi-elektronbildet til et bildet vi kan se, eller ved et CCD-kamera.

== Oppløsning ==
Ved 100kV er oppløsningen ca. 0.2nm.

De "vanlige" ligningen for depth of field and focus fra optisk mikroskopi, kan ikke lenger brukes med sikkerhet, nå som linsene ikke lenger kan defineres som "tynne" linser. Man kan likevel finne approksimerte verdier. Depht of field blir dermed 20-200nm (noe som avgrenser tykkelsen til en prøve enda mer), mens depth of focus blir flere meter!

Begrensninger på oppløsningen er gitt ved Rayleighs kriterium som for [[optisk mikroskopi]]. Man kan altså få høyere oppløsning ved høyere spenning, men en spenning opp mot 1MV vil som regel skade prøven. Man får analogt med optisk mikroskopi også sfæriske og kromatiske avik (spherical and cromatic aberrations). Sfæriske avik kommer fra at stråler i forskjellig avstand fra den optiske aksen (forskjellig vinkel) vil fokuseres ved forskjellige fokal punkt. Der en stråle lengre unna aksen vil fokuseres på et punkt nærmere linsen. Kromatiske avik kommer fra at stråler med forskjellig energi vil fokuserers ved forskjellige fokalpunkt. En stråle med høyere energi vil fokuseres på et punkt nærmere linsen.

Astigmatisme kommer fra manglende aksial symmetri ved objektiv linsene, noe som også fører til en usikkerhet i fokalpunktet. Dette kan som regel korrigeres ved magnetiske felt.

== Kontrast ==
*Mass-thickness contrast: Sannsynligheten for at et elektron blir spredd elastisk avhenger av spredningsfaktoren (atomic scattering factor), som øker med atom nummeret og det totale antall atomer. Spredningen er altså avhengig av prøvens tykkelse og tetthet, noe som gir kontrast i bildet. Amorfe og biologiske prøver vil dominerers at mass-thickness contrast.

*Diffraction contrast: Denne typen kontrast kommer fra avik i enten den eksakte betingelsen fra Braggs lov eller avik i krystallstrukturen. Det er altså både avik i det virkelige rom og i det resiproke rom som fører til kontrast. I krystallinske materialer er dette den dominate kontrasten.

*Phase contrast: I TEM kan man velge hvilke ståler man vil se på (en spredd stråle, eller den direkte strålen). For å få phase contrast må man sette aperturen slik at man velger flere stråler samtidig. Det vil dermed oppstå et interferensmønster ut i fra disse strålene pga en veiforskjell. Dette interferensmønsteret gir kontrast. Ved phase-contrast vil oppløsningen kunne bli mye bedre enn ved mass-thickness eller diffraction, helt ned til 0.07nm.

== Teknikker ==
I TEM bruker man objektivaperturen til å bestemme hvilke(n) stråle(r) man vil se på. Dette fører til mange forskjellige teknikker og kontraster.

=== Bright field ===
Her brukes den direkte elektronstrålen som har gått rett gjennom prøven. Bakgrunnen blir dermed lys, sånn som i optisk mikroskopi. Denne teknikken bruker mass-thickness contrast.

=== Dark field ===
Her brukes en spredd stråle, og analogt med optisk mikroskopi får man svart bakgrunn og bedre kontrast enn ved bright field. Denne teknikken bruker diffraction contrast. Dersom "incident beam" er rett og man velger en spredd stråle får man det man kaller dirty DF, eller lav-oppløsnings DF. Dersom man heller tilter strålen og velger strålen langs den opprinnelige optiske aksen får man høy-oppløsnings DF.

=== High Resolution TEM ===
Bruker en kombinasjon av DF og BF, altså den velger flere stråler, og bruker phase contrast. Bildet man får er i meget høy oppløsning, men kan være vanskelig å tolke pga mange interferensfenomener.

Høy oppløsning. HØY!

=== High Angle Annular Dark Field ===
Kommer av elektroner som blir avbøyd kraftig av tunge atom-kjerner (Z-kontrast). HAADF er altså avhengig av størrelsen på atomene og ikke strukturen til latticen, som vanlig DF er. Brukes kun i sammenheng med STEM (har ikke funnet noen eksempler på HAADF-TEM, kun HAADF-STEM).

=== Electron Energy-Loss Spectroscopy ===
Hvis man fjerner den vanlige detektoren i en TEM, og i stedet lar elektronene passere igjennom et magnetisk prisme slik at de blir avbøyd på grunn av [[Lorentz-kraften]], vil man kunne filtrere elektronene etter energi. Dette fordi elektroner med høy energi, og dermed høy hastighet, vil kreve en lengre distanse til å bli avbøyd 90 grader enn elektroner som går saktere. Konsekvensen blir dermed at man får skilt ut elektronene i rommet basert på deres energi, på samme måte som man kan spre lys til et spekter vha. et optisk prisme.

Slik energiatskillelse er interessant siden elektroner som blir sendt gjennom en prøve i mange tilfeller vil tape litt energi. Energien elektronene taper skyldes vekselvirkninger med materialet i prøven, og energien elektronene taper vil dermed være karakteristisk for materialet det passerer igjennom.

=== Energy Filtered TEM ===
Gitt et oppsett som ved [[EELS]], vil man etter det magnetiske prismet ha signalet spredd i rommet etter elektronenergi, og signalet vil være i [[resiprokt rom]]. Dette vil si at i et hvert "energibånd" (høydeutsnitt), vil ha et komplett romlig bilde av prøven. Hvis man da bruker et apertur til å kun velge seg ut elektroner med en viss energi, og konverterer signalet tilbake til reelt rom, vil man få et bildet av ''hvor i prøven elektroner med en viss energi kommer i fra''. Da forskjellige materialer gjerne gir større energitap for elektronene som passerer, vil man kunne bruke EFTEM til å lokalisere spesifikke materialer i prøven.

=== Scanning TEM ===
Fokuserer strålen slik at man kan scanne bildet, i stedet for å få informasjonen simultant. STEM har alle de samme funksjonene som vanlig TEM, og man kan dermed få bright field, dark field, HAADF osv. I HAADF får man nå noe som kalles z-contrast, altså en direkte sammenheng mellom den lokale kontrasten og mass-thickness kontrasten som avhenger av atom nummeret (Z).

[[Kategori: teknikker i tools]]

Scanning Electron Microscopy

2009-05-25T15:37:10Z

Ingrhal:

Optisk mikroskopi

2009-05-25T14:23:28Z

Ingrhal:

Bruk av det gode gamle mikroskopet med lys og varme og sjarm.
== Oppsett ==
Består av en kilde (lyspære), "condenser" linser og aperturer, objektivlinser og aperturer og et kamera. Condenser linsen fokuserer lyset til et fokal punkt - back focal plane, mens aperturen begrenser mengden lys. Ved å sette aperturen til at bare litt lys kommer inn øker man kontrasten, men intensiteten minker. Objektivlinsen bestemmer forstørrelsen og er avhenging av den numeriske aperturen (NA). For å øke lysstyrken kan man øke NA, men dette vil samtidig føre til en kortere "working distance".

== Oppløsning, forstørring og kontrast==
Oppløsning er gitt av Rayleighs kriterium:
<math>r=0.61\frac{\lambda}{\mu sin \alpha}</math>
der <math>\lambda</math> er bølgelengden, <math>\mu</math> er brytningsindeksen og <math>\alpha</math> er halve aperturevinkelen. <math>\mu sin \alpha</math> er gitt som den numeriske aperturen NA, som kan stilles inn på mikroskopet.
Oppløsningen er definert som den minste avstand man kan skille to punkter. Oppløsningen kan økes ved å minimerer bølgelengden eller maksimere den numeriske aperturen.

Forstørring er definert som <math>M=\frac{u}{v}</math> der u er størrelsen på bilde og v er størrelsen på objektet.

Kontrast er definert som <math>C= \frac{I_{feature}- I_{background}}{I_{background}}</math>

Depth of field er dybden man fremdeles har objektet i fokus og er gitt ved: <math>d=r tan \alpha</math>. Økende NA (økende kontrast) gir dermed mindre depth of field.

Depht of focus er dybden man fremedeles har bildet i fokus, og er gitt ved:<math>D=M^2d</math> der M er forstørrelsen og d er depth of field.

Avik i oppløsningen er gitt ved sfæriske og kromatiske avik (spherical and cromatic aberrations). Sfæriske avik kommer fra at stråler i forskjellig avstand fra den optiske aksen (forskjellig vinkel) vil fokuseres ved forskjellige fokal punkt. Der en stråle lengre unna aksen vil fokuseres på et punkt nærmere linsen. Kromatiske avik kommer fra at stråler med forskjellig bølgelengde vil fokuserers ved forskjellige fokalpunkt. En stråle med mindre bølgelengde vil fokuseres på et punkt nærmere linsen. Kromatisk avvik kan forsvinne ved bruk av monokromatisk lys.

Astigmatisme kommer fra manglende aksial symmetri ved objektiv linsene, noe som også fører til en usikkerhet i fokalpunktet. Dette kan som regel korrigeres ved å justere linsene.

==Teknikker==

===Lysefelt - Bright Field===

Sender lys inn eller ut og alt blir gjennomlyst og slik og så blir det bilder i tuten du kikker igjennom. Dette er greit å se på ting som slipper gjennom noe lys men ikke for mye, for da blir det litt vanskelig å se kontraster og slikt.

===Mørkefelt - Dark field===

Sender lyset uttafor inntaket for lys på kikketuten slik at bare lys som blir brutt av ujevnheter kommer inn og kan sees i tuten du kikker i. Spennende å se på ting som er ruglete og slippe gjennom litt lys. Kan få mangt et kult bilde med dette.

===Fasekontrast - Phase contrast===

Bruker her at en høydeforskjell i prøven gir en forskjellig veilengde for lyset, og dermed forskjellig fase. Denne forskjellen i fase brukes til å lage kontrast. For å måle forskjellen brukes en faseplate som skifter lyset enda mer. Denne kontrasten er svært god for prøver med lik brytningsindeks som bakgrunnen, for eksempel biologiske prøver.

Optiske mikropskop

2009-05-25T12:19:45Z

Ingrhal: Ny side: == Oppsett == Består av en kilde (lyspære), "condenser" linser og aperturer, objektivlinser og aperturer og et kamera. Condenser linsen fokuserer lyset til et fokal punkt - back focal pla...

Transmission Electron Microscopy

2009-05-25T10:53:47Z

Ingrhal:

Dette er et av to typer elektronmikroskop. Med en TEM får man god oppløsning, omtrent ned på atomært nivå. Denne saken sender elektroner ned gjennom et rør som innehar en del elektromagnetiske linser som får alt til å bli bra. Det er flere forskjellige ting man kan få ut av og gjøre med en TEM og noen forskjellige saker står derfor under. Den viktikste egenskapen til en TEM er at den kombinerer informasjon fra både det virkelige rom (real space) og det resiproke rom (reciprocal space).

== Oppsett ==
Kilden er en elektronkanon med en svært høy spenning (100-400kV). Elektronkanonen kan være av forskjellige typer (filamenter eller "tip"er), men det mest vanlige materialet er Wolfram (Tungsten). Elektronene blir så akselrert av en anode holdt ved jord. Strålen er karakteristert av den effektive størrelsen, vinkelen, elektronenergien og spredningen av elektronenergier. En liten effektiv størrelse forbedrer strålens koherens.

"Condenser" aperturen er elektromagnetiske linser som fokuserer elektronstrålen. De har samme funksjon som condenser aperturen i [[optiske mikropskop]]. Forskjellen er at man her kan variere fokal lengden, ved å variere strømmen som går i linsene. Elektronene vil følge en heliks bane pga det elektromagnetsike feltet.

Prøvematerialet kan både roteres og vippes. Diameteren på prøven må være under 3mm, og tykkelsen må være under 0.1 <math>\mu m</math>, for å få elastisk spredning (scattering).

Bildet blir laget av en "flourescent" skjerm som konverterer høy-energi-elektronbildet til et bildet vi kan se, eller ved et CCD-kamera.

== Oppløsning ==
Ved 100kV er oppløsningen ca. 0.2nm.

De "vanlige" ligningen for depth of field and focus fra optisk mikroskopi, kan ikke lenger brukes med sikkerhet, nå som linsene ikke lenger kan defineres som "tynne" linser. Man kan likevel finne approksimerte verdier. Depht of field blir dermed 20-200nm (noe som avgrenser tykkelsen til en prøve enda mer), mens depth of focus blir flere meter!

Begrensninger på oppløsningen er gitt ved Rayleighs kriterium som for [[optisk mikroskopi]]. Man kan altså få høyere oppløsning ved høyere spenning, men en spenning opp mot 1MV vil som regel skade prøven. Man får analogt med optisk mikroskopi også sfæriske og kromatiske avik (spherical and cromatic aberrations). Sfæriske avik kommer fra at stråler i forskjellig avstand fra den optiske aksen (forskjellig vinkel) vil fokuseres ved forskjellige fokal punkt. Der en stråle lengre unna aksen vil fokuseres på et punkt nærmere linsen. Kromatiske avik kommer fra at stråler med forskjellig energi vil fokuserers ved forskjellige fokalpunkt. En stråle med høyere energi vil fokuseres på et punkt nærmere linsen.

Astigmatisme kommer fra manglende aksial symmetri ved objektiv linsene, noe som også fører til en usikkerhet i fokalpunktet. Dette kan som regel korrigeres ved magnetiske felt.

== Kontrast ==
*Mass-thickness contrast: Sannsynligheten for at et elektron blir spredd elastisk avhenger av spredningsfaktoren (atomic scattering factor), som øker med atom nummeret og det totale antall atomer. Spredningen er altså avhengig av prøvens tykkelse og tetthet, noe som gir kontrast i bildet. Amorfe og biologiske prøver vil dominerers at mass-thickness contrast.

*Diffraction contrast: Denne typen kontrast kommer fra avik i enten den eksakte betingelsen fra Braggs lov eller avik i krystallstrukturen. Det er altså både avik i det virkelige rom og i det resiproke rom som fører til kontrast. I krystallinske materialer er dette den dominate kontrasten.

*Phase contrast: I TEM kan man velge hvilke ståler man vil se på (en spredd stråle, eller den direkte strålen). For å få phase contrast må man sette aperturen slik at man velger flere stråler samtidig. Det vil dermed oppstå et interferensmønster ut i fra disse strålene pga en veiforskjell. Dette interferensmønsteret gir kontrast. Ved phase-contrast vil oppløsningen kunne bli mye bedre enn ved mass-thickness eller diffraction, helt ned til 0.07nm.

== Teknikker ==
I TEM bruker man objektivaperturen til å bestemme hvilke(n) stråle(r) man vil se på. Dette fører til mange forskjellige teknikker og kontraster.

=== Bright field ===
Her brukes den direkte elektronstrålen som har gått rett gjennom prøven. Bakgrunnen blir dermed lys, sånn som i optisk mikroskopi. Denne teknikken bruker mass-thickness contrast.

=== Dark field ===
Her brukes en spredd stråle, og analogt med optisk mikroskopi får man svart bakgrunn og bedre kontrast enn ved bright field. Denne teknikken bruker diffraction contrast.

=== High Resolution TEM ===
Bruker en kombinasjon av DF og BF, altså den velger flere stråler, og bruker phase contrast. Bildet man får er i meget høy oppløsning, men kan være vanskelig å tolke pga mange interferensfenomener.

Høy oppløsning. HØY!

=== High Angle Annular Dark Field ===
Kommer av elektroner som blir avbøyd kraftig av tunge atom-kjerner (Z-kontrast). HAADF er altså avhengig av størrelsen på atomene og ikke strukturen til latticen, som vanlig DF er.

=== Electron Energy-Loss Spectroscopy ===
Hvis man fjerner den vanlige detektoren i en TEM, og i stedet lar elektronene passere igjennom et magnetisk prisme slik at de blir avbøyd på grunn av [[Lorentz-kraften]], vil man kunne filtrere elektronene etter energi. Dette fordi elektroner med høy energi, og dermed høy hastighet, vil kreve en lengre distanse til å bli avbøyd 90 grader enn elektroner som går saktere. Konsekvensen blir dermed at man får skilt ut elektronene i rommet basert på deres energi, på samme måte som man kan spre lys til et spekter vha. et optisk prisme.

Slik energiatskillelse er interessant siden elektroner som blir sendt gjennom en prøve i mange tilfeller vil tape litt energi. Energien elektronene taper skyldes vekselvirkninger med materialet i prøven, og energien elektronene taper vil dermed være karakteristisk for materialet det passerer igjennom.

=== Energy Filtered TEM ===
Gitt et oppsett som ved [[EELS]], vil man etter det magnetiske prismet ha signalet spredd i rommet etter elektronenergi, og signalet vil være i [[resiprokt rom]]. Dette vil si at i et hvert "energibånd" (høydeutsnitt), vil ha et komplett romlig bilde av prøven. Hvis man da bruker et apertur til å kun velge seg ut elektroner med en viss energi, og konverterer signalet tilbake til reelt rom, vil man få et bildet av ''hvor i prøven elektroner med en viss energi kommer i fra''. Da forskjellige materialer gjerne gir større energitap for elektronene som passerer, vil man kunne bruke EFTEM til å lokalisere spesifikke materialer i prøven.

=== Scanning TEM ===
Fokuserer strålen slik at man kan scanne bildet, i stedet for å få informasjonen simultant. STEM har alle de samme funksjonene som vanlig TEM, og man kan dermed få bright field, dark field, HAADF osv. I HAADF får man nå noe som kalles z-contrast, altså en direkte sammenheng mellom den lokale kontrasten og mass-thickness kontrasten som avhenger av atom nummeret (Z).

Hovedekskursjon 2010

2009-05-02T20:06:23Z

Ingrhal: /* Attraksjoner */

Denne artikkelen inneholder informasjon om hovedekskursjonen til MTNANOs kull 2007.

= Tidsplan =
* 24.03.2009: Deadline for [http://www.timini.no/forum/viewtopic.php?t=1622 idémyldring på forumet]
* 04.05.2009 10:15-12:00, R3: Allmøte med presentasjon av reisemålene og avstemming
* 19.03.2010: Planlagt avreise
* 09.04.2010: Planlagt hjemreise

=California=

===Drillo-fakta===
Hovedstad: Sacramento

Guvernør: Arnold Schwarzenegger (R)

===Nanoteknologi-bedrifter===

Silicon Valley ligger den sørlige derlen av San Fransico Bay Area i Northern California og har fått navnet sitt på grunn av områdets høye konsentrasjon av innovative elektronikkbedrifter. Med tiden dette området blitt et slags symbol på nyskapning, entrepenørskap og ingeniørbragder. Silicon Valley er USAs ledende high-tech industriområde med bedrifter som (med forbehold om at ikke alle er direkte nanorelevante):
*'''Advanced Micro Devices (AMD)'''
*Apple Inc.
*'''Applied Materials'''
*Google
*[http://www.intel.com/ '''Intel''']
*LSI Logic
*'''National Semiconductor'''
*Sun Microsystems
*Asus
*Atari
*Cypress Semiconductor
*Facebook
*'''IBM Almaden Research Center'''
*Opera Software
*Tesla Motors
*'''Sun Power'''
*NASA Ames Research Center

I tillegg ligger det mange biorelevante bedrifter i området rundt San Fransico bay. Eksempler er:
*Quantum Dot Corporation

===Økonomi===
*Visum
**Må ha elektronsik pass, for nytt pass 450 NOK (Kilde: politi.no)
**Koster 750 NOK (Kilde: Den amerikanske ambassade)
*Reiseforsikring
**Kan gjøres billig, eller f.eks. Europeiske, verden helår: 1215 NOK
*Flybilletter
**Trondheim - San Francisco apprxo. 7 000 - 8 000 NOK (Kilde: kelkoo.no)
**Oslo - San Francisco ned mot 5 000 NOK (Kilde: kelkoo.no)
*Overnatting
**approx. 200 NOK night^-1 for hostel (Kilde: hostels.com)
*Øl
**25-35 NOK arbitary beer unit^-1. I byen Chico kan man imidlertid få en duggfrisk til under 12 kr (Kilde: pintprice.com).

===Attraksjoner===
*San Fransisco
**Alcatraz
**Golden Gate
**Golden Gate Park
**Myth Busters + lignende serier fra Discovery Channel?
**Twin peaks
*Los Angeles
**Santa Monica Beach
**Venice Beach
**Hollywood
**Mexico?

===Universiteter===
*California Institute of Technology (CALTECH)
**Kavli nanoscience institute driver forskning blant annet innen bionanoteknologi og nanofotinikk
*University of California @ Berkeley, San Diego og Santa Barbara
**Har utvekslingsavtale med NTNU

===Annet===

=Vest-Europa=

===Drillo-fakta===

===Nanoteknologi-bedrifter===

===Økonomi===

Vanlige ølpriser er Frankrike er ca 50 kr i følge pintprice.com. 40 kr er typisk i Barcelona, mens man i Sveits slipper unna med 35 kr.
[[Image:Inter.jpg|left|thumb|500px|]]

===Attraksjoner===
*Frankrike
** Paris!
** Vinsmaking i Bourgogne, Champagne eller Bordeaux

===Universiteter med samarbeidsavtaler med NTNU===
*Frankrike
** INSA Toulouse
** UTT
**Université de téchnologie de Compiègne
**INPG - ENSIMAG
**Ecole Superieure d'Ingenieurs de Marseille
**Ecole National Chimie de Paris
**Université de Poitiers
**Institut National Polytechnique de Grenoble

Bare i Paris er det 7 universiteter, 6 "grandes écoles" og 84 instutisjoner som kommer under den nasjonale handlingsplanen for nanoteknologi i Frankrike.

===Annet===

=Kina=

===Drillo-fakta===

===Nanoteknologi-bedrifter===

'''Advapowder'''
Produces nanoscale diamond powder.

'''AgroMicron'''
The company develops Rapid Early Detection products. These products identify possible pathological threats from bioterrorism to pathogens plaguing global agriculture, animals and people. Test arrays include nanoscale molecule detection techniques.

'''AlphaNano Technology'''
A manufacturer of carbon nanotubes and other nanoparticles.

'''Anson Nanotechnology Group'''
Manufactures nanoparticulate antibacterial dressings.

'''Arry International Group Limited'''
Supplier of a wide variety of nano materials, including carbon nanotubes (CNTs) and nano elements as as well as nano oxides (rare earth, metal, and non-metal).

'''Beijing Chamgo Nano-Tech'''
Manufactures antimicrobial fibers and plastics and nanocomposite materials.

'''Beijing HuiHaihong Nano-ST'''
The company is mainly engaged in the application research of nanometer-structured material, R&D of new products, technology transfer, technical consultation, technical service, production and management of the newly developed products.

'''Chengdu Alpha Nano Technology'''
A supplier of carbon nanotubes and various nanopowders.

'''Chengdu Organic Chemistry Co.'''
Producer of carbon nanotubes.

'''Chengyin Technology'''
Producer of nanoparticles.

'''China Rare Metal Material'''
CRM offers a wide range of nanoparticulate specialist metals, oxides, alloys and inorganic chemical compounds.

'''Chongyi Zhangyuan Tungsten Co., Ltd.'''
Producer of tungsten and tungsten carbide nanopowders.

'''EnvironmentalCare'''
Manufactures nano-TiO2 catalytic surface coating materials.

'''FCC'''
The company produces 6 series of more than 20 different items bentonite refined products,including NANOLIN series of nanoclay.

'''Futuresoft Technologies'''
Futuresoft Technologies Inc. is specialized in technologies in plastic materials, their processing equipment and processed products. FTI offers turn-key production systems of wood-plastic composite, extruders, and dies, especially profile dies for wood-plastic, PVC, and TPE. Their polymer nanocomposite technology has been able to make the composite to have much higher property enhancement than those by other technology.

'''HeFei Kaier Nanometer Technology Development Co.'''
Specializes in nitride and carbide series of nanoparticle ceramic powders.

'''HeJi, Inc.'''
Producer of carbon nanotubes.

'''Huizhou TianYi Rare Material'''
Manufacturer of nanopowders.

'''Jiangsu Changtai Nanometer Material Co, Ltd.'''
Producer of nanoparticles.

'''Jinri Diamond'''
The company produces diamond abrasives. Among its products are nanodiamond materials.

'''NaBond'''
Focused on development, manufacture and application of nanomaterials and adhesives.

'''Nano-Group Holdings'''
Provides nanotechnology applications for the textile and garment industries.

'''Semiconductor Manufacturing International Corporation (SMIC)'''
SMIC is one of the leading semiconductor foundries in the world and the largest and most advanced foundry in Mainland China, providing integrated circuit manufacturing service at 0.35 micron to 65 nanometer and finer line technologies.

'''Shanghai ADD Nano-ST'''
Manufactures PTFE nanopowders for printing, dyeing, and cosmetic applications.

'''ShangHai Allrun Nano Science & Technology'''
Allrun Nano's technologies consist of distinct nanomaterial manufacturing processes, surface treatment technologies of nanomaterial, and its bio-medical application technologies. Allrun Nano has created an integrated platform of nanomaterial technologies that are designed to deliver nanomaterial solutions for market applications.

'''Shanghai Huzheng Nano Technology'''
Producer of wide range of nanoparticles, coating supplements and finishing agents.

'''Shanghai Shanghui Nano Science and Technology'''
The company specializes in the R&D, production and distribution of high-tech industrial products of nanomaterials. In possession of its own centre of R&D and integrating production with industrialization, the company cooperates with colleges and scientific institutions with regard to the projects of nanomaterials and technologies.

'''Shenzen Nano-Technologies Port Co., Ltd.'''
Producer of carbon nanotubes.

'''Shenzhen JinGangYuan New Material Development'''
The company specializes in developing and manufacturing nanodiamond and other related products.

'''Shenzhen Junye Nano Material Co.'''
Produces metal nanoparticles.

'''Shenzhen Nanotechnologies'''
The company is focusing on the R&D, manufacture and application of carbon nanotubes.

'''Sokang Nano'''
Develops several lines of nanotech product including nano coating, nano coating additive, nano air cleaner module and nano water cleaning module.

'''Sumi Long Nanotechnology Materials'''
(Site in Chinese) A subsidiary of Sumitomo Osaka Cement, the company develops and manufactures antimagnetic, anti-reflection coatings with nanoparticles.

'''Sun Nanotech Co, Ltd.'''
Supplier of carbon nanotubes.

'''Texnology Nano Textile'''
Applies nanocoatings to textile fibers and materials.

'''TiPE'''
TiPE is a leading nano photocatalyst manufacturer in China, with its proprietary advanced Nano-hydrosynthetic™ technology. TiPE also is the biggest hydrosynthetic photocatalyst manufacturer in China.

'''TitanPE Technology (Shanghai) Inc.'''
Produces nano photocatalysts.

'''Yantai Jialong Nano Industry'''
The company conducts research and development of nanomaterials. It is the 863 Program Industrialization Base, Shandong Nanocoating Engineering & technology Research Center and Yantai Nano Engineering & Technology Research Center.

'''Zhejiang Fenghong Clay Chemicals'''
Engages in research, development, manufacture and trade of refined clay related products such as organoclay rheological additives ornanoclay for polymers.

'''Zibo ShineSo Chemical New Material'''
ShineSo specializes in the R&D, manufacturing distribution and technical service of advanced ceramic materials including nanopowders.

===Økonomi===

I følge pintprice.com er det store geografiske variasjoner i ølprisene i Kina; fra under 2 kr i Changchun til over 40 kr i Shanghai. I Beijing er prisen ca 10 kr.

===Attraksjoner===

===Universiteter med samarbeidsavtaler med NTNU===

===Annet===

=Japan=

===Drillo-fakta===
Hovedstad: Tokyo

Innbygggertall: 127 millioner

Språk: Japansk

===Nanoteknologi-bedrifter===

===Økonomi===

Pintprice.com hevder at snittprisen på en øl i Japan er 35 kr. I hovedstaden Tokyo er prisen opp mot 50-lappen.

===Attraksjoner===
Byen Nagano (De japanske Alper)
De fleste kjenner Nagano som vertsby for vinter-OL 1998. Byen er den største i området og blant dens fineste severdighet er Zenkoji tempelet som absolutt bør ses hvis man kommer til de japanske alpene.

Skiområdet (De japanske Alper)
De berømte skisportsstedene ligger et stykke utenfor Nagano. Mange av de beste skiområdene ligger i Shiga platået og i nasjonalparken Joshin-Etsu Kogen Kokuritsu -Koen. Innimellom alle disse skisportsstedene ligger mange deilige kursteder.

De fem sjøene ved Fuji (Fujiyama)
I nærheten av Fuji ligger De fem sjøene. Sjøene er berømte for deres skjønnhet og det er mulig å dyrke vannsport ved sjøene. Det er også forlystelsesparker i området. Man kommer lettest ut til sjøene med buss eller svevebane.

Kursteder ved Hakone (Fujiyama)
Hvis man er til kursteder og varme kilder bør man reise til Hakone. De fleste kurstedene ligger omkring Ashinoko sjøen. Prøv en seiltur på sjøen eller ta svevebanen eller toget til Owakudani hvor de fleste varme kildene ligger.

Atombombekuppelen (Genbaku Domu) (Hiroshima)
Genbaku Domu er det siste som står tilbake av vitnesbyrd på atombombens ødeleggelser i 1945. Opprinnelig var bygningen en industrihall, men stålskjelettet som står tilbake minner om en langt vakrere bygning. Bygningens minner om blodig fortid står i skarp kontrast til nåtidens Hiroshima.

Hiroshima borgen (Hiroshima)
Hiroshima borgen er, som alt annet i Hiroshima, ikke mer enn 55 år gammel. Allikevel lever borgen opp til alle ens fantasier om gammel japansk middelalderborg. I tårnet er det en spennende utstilling med våpen og rustninger.

Torii porten (Hiroshima)
Torii porten ligger 20 kilometer fra Hiroshima. De fleste vil gjenkjenne den fra bilder og film om Japan uten å kjenne den ved navn. Torii porten er 17 meter høy, bygget av rødt tre og står midt ute i vannet utenfor Shintotempel øyen Miyajima. Nyt også den praktfulle naturen på øyen.

Fjellet Fuji (Japan)
Fuji er Japans høyeste fjell. Offisielt kan man kun bestige Fuji i juli og august, men det kan i virkeligheten gjøres hele året, selv om det krever en del rutine i vinterhalvåret. Skiltingen er god og man går seg ikke bort.

Meiji Jingu Tempelet (Tokyo)
Tempelet er imponerende og ligger i en av Tokyos vakre parker og er blant de helligste i Japan. Nyttårsdag besøker mange japanere dette tempelet iført kimonoer. Tempelet er dedikert til keiser Meiji som i sin tid åpnet Japan for omverdenen. Tempelet inneholder mange av keiserens personlige eiendeler. Parkens irishage er blant Japans vakreste.

Sanjusangendo Tempelet (Kyoto)
Sanjusangendo tempelet i Kyoto er et imponerende stort tempel. Det stod ferdig i 1266 og de 1001 statuene er et av Kamukara periodens mesterverker. Den 15. januar holdes den årlige bueskytingskonkurransen. En tradisjon som stammer fra det 16. århundre.

Gullpaviljongen (Kyoto)
Kinkakuji (gullpaviljongen) er en av Kyotos absolutte severdigheter. Tempelet ble oppført i det 14. århundre, men måtte gjenoppføres i 1955 etter at en sinnsyk tempelprest brendte det ned. Tempelet er dekket med bladgull og er en nøyaktig kopi av det gamle Kinkakuji.

Keiserpalasset i Kyoto (Kyoto)
Keiserpalasset er en av de få serverdigheten i Kyotos sentrum. Det nåværende palasset ble oppført i 1855 som erstatning for et tidligere nedbrendt palass. Palasset kan kun besøkes i grupper. Rundvisningene er veldig ettertraktet og det kan anbefales å søke om plass til disse turene allerede en dag i forveien.

Byen Nara (Nara)
Byen Nara ligger en halv times togtur fra Kyoto. I Nara gjenfinner man Kyotos særlige atmosfære. Byen ble i 710 Japans første permanente hovedstad og har mange velbevarte templer. I Nara Park går det tamme hjort rundt mellom templene.

Borgen i Himeji (Osaka)
Himeji ligger halvannen times togtur fra Osaka. Byen rommer kanskje Japans vakreste borg som mange nok vil huske fra tv-serien "Shogun". Den Hvite Hejres Borg (Shirasagi-jo) er et fantastisk byggeri som med sine hvite murer og kurvede tegltak emmer av østens mystikk, innvendig som utvendig. Til borgen er det knyttet to museer og den berømte kirkegården Nagayama.

Borgen i Osaka (Osaka)
Borgen i Osaka byr på våpen og maleriutstillinger. Borgen er opprinnelig fra det 16. århundre, men har brendt ned et par ganger siden. Borgen er restaurert og har innvendig heis. Ved siden av borgen ligger Osaka bymuseum med samlinger relatert til byens historie samt en mindre keramikksamling.

Senri Expo Park (Osaka)
Litt nord for Osaka ligger Senri Expo Park hvor Expo ble holdt i 1970. Her finner man blant annet den vakre landskapshagen som ble anlagt i forbindelse med Expo utstillingen. Det hører også et etnologisk museum til parken hvor det utstilles ting og film fra hele verden.

Bryggeriet i Sapporo (Sapporo)
På Sapporos bryggeri kan alle ølelskere komme på en gratis rundvisning og smake den gode japanske bryggekunst.

Nakajima Koen parken (Sapporo)
Ønsker man en forsmak på Hokkaidos skjønne natur bør man besøke Nakajima Koen parken. Her kan man slappe av i parkens landskapshage og besøke det historiske tehuset.

Disneyland i Tokyo (Tokyo)
Disneyland i Tokyo er en tro kopi av Disneyland i California og har de samme attraksjonene. Forlystelsesparken ble innviet i 1983 og har vært en enorm suksess siden. Hvis man ennå ikke har opplevd Disneyland bør man gripe sjansen her. For å unngå trengsel bør man dra der i hverdagene.

Ginza distriktet (Tokyo)
Litt sydøst for keiserpalasset ligger Ginza distriktet hvor den mest kjøpelystne kan slå seg løs. Her ligger det mange spesialbutikker og stormagasiner. I kvarteret kan man finne mange utenlandske aviser og tollfrie butikker.

Keiserpalasset (Tokyo)
Keiserpalasset er en av de severdighetene man bør besøke under oppholdet i Tokyo. Det er ikke adgang til selve palasset hvor keiserfamilien bor, men gå en tur i parken og nyt utsikten innover palasset.

===Universiteter med samarbeidsavtaler med NTNU===

===Annet===

=Singapore og Malaysia=

===Drillo-fakta===

===Nanoteknologi-bedrifter===

===Økonomi===

En øl kan fås til 20 kr i Singapore i følge pintprice.com, men man må regne med minst det dobbelte mange steder. Snittprisen i Malaysia er 37 kr.

===Attraksjoner===

===Universiteter med samarbeidsavtaler med NTNU===

===Annet===

Hovedekskursjon 2010

2009-05-02T19:59:09Z

Ingrhal: /* Drillo-fakta */

Hovedekskursjon 2010

2009-05-02T19:58:25Z

Ingrhal: /* Drillo-fakta */

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-31T15:53:41Z

Ingrhal: /* Kilder */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin)<ref name="bio">Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006</ref>. To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten<ref name="spr">A. Pinchuk, U. Kreibig and A. Hilger, Optical properties of metallic nanoparticles: influence of interface effects and interband transitions, 2004</ref>. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, kan man kontrollere sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder for å lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider<ref name="konsam">Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005</ref>. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^{2+}</math>), kobber (Cu<math>^{2+}</math>) og kvikksølv (Hg<math>^{2+}</math>). Alle disse tre bruker litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. . I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^{2+}</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E) (se figur 4). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner, hvis det skulle være ønskelig.
[[Bilde:bly.jpg|400px|center|thumb|Figur 4 A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|Figur 5: A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Figur 6: Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2) (se figur 5). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^{2+}</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^{2+}</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^{2+}</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^{2+}</math>, Sr<math>^{2+}</math>, Ni<math>^{2+}</math>, Fe<math>^{2+}</math>, Mg<math>^{2+}</math>, Zn<math>^{2+}</math>. Bare Cu<math>^{2+}</math> og Zn<math>^{2+}</math> ga noe som helst utslag, og Zn<math>^{2+}</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner (se figur 6). Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^{2+}</math> til løsningen, vil Hg<math>^{2+}</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix (se figur 7). Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^{2+}</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^{2+}</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Figur 8: Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^{2+}</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^{2+}</math> (se figur 8). TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|center|Figur 7: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener<ref name="antigen">Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005</ref>. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 8).

[[Bilde:gen.JPG|350px|left|thumb|Tabell 1: Fem forskjellige oligonukletider]]
[[Bilde:gen2.JPG|300px|center|thumb|Figur 8: Syntese av hybridmolekyler]]

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 9.

[[Bilde:gen3.JPG|300px|center|thumb|Figur 9: Hybridmolekyl med antistoff og antigen]]

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 10). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

[[Bilde:gen4.JPG|400px|center|thumb|Figur 10: Hybridmolekylet blir bundet til en overflate, og det blir laget flere lag med nanopartikler.]]

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 11 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

[[Bilde:gen5.JPG|400px|center|thumb|Figur 11: Histogram over abosbering av elektromagnetisk stråling ved difunksjonelle hybdridmolekyler (svarte søyler) og monofunksjonelle hybridmolekyler (grå søyler).]]

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.
[[Bilde:phmeter.JPG|200px|left|thumb|Figur 11: skjematisk figur av I-motif- DNA.]]

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.
[[Bilde:phmeter2.JPG|400px|center|thumb|Figur 12: A: skjematisk figur av prosessen med nanopartikler og I-motif DNA, B: fargeendring i pH-området 5.00-8.00]]

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-31T15:52:37Z

Ingrhal: /* Blysensor: */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin)<ref name="bio">Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006</ref>. To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten<ref name="spr">A. Pinchuk, U. Kreibig and A. Hilger, Optical properties of metallic nanoparticles: influence of interface effects and interband transitions, 2004</ref>. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, kan man kontrollere sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder for å lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider<ref name="konsam">Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005</ref>. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^{2+}</math>), kobber (Cu<math>^{2+}</math>) og kvikksølv (Hg<math>^{2+}</math>). Alle disse tre bruker litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. . I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^{2+}</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E) (se figur 4). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner, hvis det skulle være ønskelig.
[[Bilde:bly.jpg|400px|center|thumb|Figur 4 A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|Figur 5: A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Figur 6: Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2) (se figur 5). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^{2+}</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^{2+}</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^{2+}</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^{2+}</math>, Sr<math>^{2+}</math>, Ni<math>^{2+}</math>, Fe<math>^{2+}</math>, Mg<math>^{2+}</math>, Zn<math>^{2+}</math>. Bare Cu<math>^{2+}</math> og Zn<math>^{2+}</math> ga noe som helst utslag, og Zn<math>^{2+}</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner (se figur 6). Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^{2+}</math> til løsningen, vil Hg<math>^{2+}</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix (se figur 7). Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^{2+}</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^{2+}</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Figur 8: Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^{2+}</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^{2+}</math> (se figur 8). TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|center|Figur 7: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener<ref name="antigen">Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005</ref>. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 8).

[[Bilde:gen.JPG|350px|left|thumb|Tabell 1: Fem forskjellige oligonukletider]]
[[Bilde:gen2.JPG|300px|center|thumb|Figur 8: Syntese av hybridmolekyler]]

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 9.

[[Bilde:gen3.JPG|300px|center|thumb|Figur 9: Hybridmolekyl med antistoff og antigen]]

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 10). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

[[Bilde:gen4.JPG|400px|center|thumb|Figur 10: Hybridmolekylet blir bundet til en overflate, og det blir laget flere lag med nanopartikler.]]

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 11 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

[[Bilde:gen5.JPG|400px|center|thumb|Figur 11: Histogram over abosbering av elektromagnetisk stråling ved difunksjonelle hybdridmolekyler (svarte søyler) og monofunksjonelle hybridmolekyler (grå søyler).]]

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.
[[Bilde:phmeter.JPG|200px|left|thumb|Figur 11: skjematisk figur av I-motif- DNA.]]

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.
[[Bilde:phmeter2.JPG|400px|center|thumb|Figur 12: A: skjematisk figur av prosessen med nanopartikler og I-motif DNA, B: fargeendring i pH-området 5.00-8.00]]

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-31T15:52:19Z

Ingrhal: /* Blysensor: */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin)<ref name="bio">Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006</ref>. To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten<ref name="spr">A. Pinchuk, U. Kreibig and A. Hilger, Optical properties of metallic nanoparticles: influence of interface effects and interband transitions, 2004</ref>. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, kan man kontrollere sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder for å lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider<ref name="konsam">Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005</ref>. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^{2+}</math>), kobber (Cu<math>^{2+}</math>) og kvikksølv (Hg<math>^{2+}</math>). Alle disse tre bruker litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. . I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^{2+}</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E) (se figur 4). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner, hvis det skulle være ønskelig.
[[Bilde:bly.JPG|400px|center|thumb|Figur 4 A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|Figur 5: A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Figur 6: Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2) (se figur 5). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^{2+}</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^{2+}</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^{2+}</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^{2+}</math>, Sr<math>^{2+}</math>, Ni<math>^{2+}</math>, Fe<math>^{2+}</math>, Mg<math>^{2+}</math>, Zn<math>^{2+}</math>. Bare Cu<math>^{2+}</math> og Zn<math>^{2+}</math> ga noe som helst utslag, og Zn<math>^{2+}</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner (se figur 6). Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^{2+}</math> til løsningen, vil Hg<math>^{2+}</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix (se figur 7). Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^{2+}</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^{2+}</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Figur 8: Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^{2+}</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^{2+}</math> (se figur 8). TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|center|Figur 7: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener<ref name="antigen">Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005</ref>. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 8).

[[Bilde:gen.JPG|350px|left|thumb|Tabell 1: Fem forskjellige oligonukletider]]
[[Bilde:gen2.JPG|300px|center|thumb|Figur 8: Syntese av hybridmolekyler]]

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 9.

[[Bilde:gen3.JPG|300px|center|thumb|Figur 9: Hybridmolekyl med antistoff og antigen]]

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 10). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

[[Bilde:gen4.JPG|400px|center|thumb|Figur 10: Hybridmolekylet blir bundet til en overflate, og det blir laget flere lag med nanopartikler.]]

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 11 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

[[Bilde:gen5.JPG|400px|center|thumb|Figur 11: Histogram over abosbering av elektromagnetisk stråling ved difunksjonelle hybdridmolekyler (svarte søyler) og monofunksjonelle hybridmolekyler (grå søyler).]]

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.
[[Bilde:phmeter.JPG|200px|left|thumb|Figur 11: skjematisk figur av I-motif- DNA.]]

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.
[[Bilde:phmeter2.JPG|400px|center|thumb|Figur 12: A: skjematisk figur av prosessen med nanopartikler og I-motif DNA, B: fargeendring i pH-området 5.00-8.00]]

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Fil:Bly.jpg

2009-03-31T15:51:54Z

Ingrhal:

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-31T15:41:10Z

Ingrhal: /* Detektering av antigener */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin)<ref name="bio">Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006</ref>. To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, kan man kontrollere sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder for å lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider<ref name="konsam">Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005</ref>. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^{2+}</math>), kobber (Cu<math>^{2+}</math>) og kvikksølv (Hg<math>^{2+}</math>). Alle disse tre bruker litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. . I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^{2+}</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E) (se figur 4). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner, hvis det skulle være ønskelig.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|Figur 4 A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|Figur 5: A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Figur 6: Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2) (se figur 5). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^{2+}</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^{2+}</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^{2+}</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^{2+}</math>, Sr<math>^{2+}</math>, Ni<math>^{2+}</math>, Fe<math>^{2+}</math>, Mg<math>^{2+}</math>, Zn<math>^{2+}</math>. Bare Cu<math>^{2+}</math> og Zn<math>^{2+}</math> ga noe som helst utslag, og Zn<math>^{2+}</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner (se figur 6). Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^{2+}</math> til løsningen, vil Hg<math>^{2+}</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix (se figur 7). Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^{2+}</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^{2+}</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Figur 8: Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^{2+}</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^{2+}</math> (se figur 8). TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|center|Figur 7: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener<ref name="antigen">Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005</ref>. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 8).

[[Bilde:gen.JPG|350px|left|thumb|Tabell 1: Fem forskjellige oligonukletider]]
[[Bilde:gen2.JPG|300px|center|thumb|Figur 8: Syntese av hybridmolekyler]]

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 9.

[[Bilde:gen3.JPG|300px|center|thumb|Figur 9: Hybridmolekyl med antistoff og antigen]]

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 10). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

[[Bilde:gen4.JPG|400px|center|thumb|Figur 10: Hybridmolekylet blir bundet til en overflate, og det blir laget flere lag med nanopartikler.]]

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 11 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

[[Bilde:gen5.JPG|400px|center|thumb|Figur 11: Histogram over abosbering av elektromagnetisk stråling ved difunksjonelle hybdridmolekyler (svarte søyler) og monofunksjonelle hybridmolekyler (grå søyler).]]

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.
[[Bilde:phmeter.JPG|200px|left|thumb|Figur 11: skjematisk figur av I-motif- DNA.]]

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.
[[Bilde:phmeter2.JPG|400px|center|thumb|Figur 12: A: skjematisk figur av prosessen med nanopartikler og I-motif DNA, B: fargeendring i pH-området 5.00-8.00]]

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-31T15:37:55Z

Ingrhal: /* Kolorimetrisk pH-meter */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin)<ref name="bio">Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006</ref>. To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, kan man kontrollere sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder for å lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider<ref name="konsam">Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005</ref>. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^{2+}</math>), kobber (Cu<math>^{2+}</math>) og kvikksølv (Hg<math>^{2+}</math>). Alle disse tre bruker litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. . I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^{2+}</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E) (se figur 4). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner, hvis det skulle være ønskelig.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|Figur 4 A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|Figur 5: A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Figur 6: Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2) (se figur 5). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^{2+}</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^{2+}</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^{2+}</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^{2+}</math>, Sr<math>^{2+}</math>, Ni<math>^{2+}</math>, Fe<math>^{2+}</math>, Mg<math>^{2+}</math>, Zn<math>^{2+}</math>. Bare Cu<math>^{2+}</math> og Zn<math>^{2+}</math> ga noe som helst utslag, og Zn<math>^{2+}</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner (se figur 6). Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^{2+}</math> til løsningen, vil Hg<math>^{2+}</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix (se figur 7). Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^{2+}</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^{2+}</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Figur 8: Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^{2+}</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^{2+}</math> (se figur 8). TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|center|Figur 7: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener<ref name="antigen">Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005</ref>. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 8).
[[Bilde:gen.JPG|350px|left|thumb|Tabell 1: Fem forskjellige oligonukletider]]
[[Bilde:gen2.JPG|300px|center|thumb|Figur 8: Syntese av hybridmolekyler]]

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 9.
[[Bilde:gen3.JPG|300px|center|thumb|Figur 9: Hybridmolekyl med antistoff og antigen]]

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 10). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.
[[Bilde:gen4.JPG|400px|center|thumb|Figur 10: Hybridmolekylet blir bundet til en overflate, og det blir laget flere lag med nanopartikler.]]

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 11 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.
[[Bilde:gen5.JPG|400px|center|thumb|Figur 11: Histogram over abosbering av elektromagnetisk stråling ved difunksjonelle hybdridmolekyler (svarte søyler) og monofunksjonelle hybridmolekyler (grå søyler).]]

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.
[[Bilde:phmeter.JPG|200px|left|thumb|Figur 11: skjematisk figur av I-motif- DNA.]]

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.
[[Bilde:phmeter2.JPG|400px|center|thumb|Figur 12: A: skjematisk figur av prosessen med nanopartikler og I-motif DNA, B: fargeendring i pH-området 5.00-8.00]]

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-31T15:37:17Z

Ingrhal: /* Kvikksølvsensor: */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin)<ref name="bio">Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006</ref>. To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, kan man kontrollere sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder for å lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^{2+}</math>), kobber (Cu<math>^{2+}</math>) og kvikksølv (Hg<math>^{2+}</math>). Alle disse tre bruker litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. . I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^{2+}</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E) (se figur 4). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner, hvis det skulle være ønskelig.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|Figur 4 A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|Figur 5: A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Figur 6: Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2) (se figur 5). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^{2+}</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^{2+}</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^{2+}</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^{2+}</math>, Sr<math>^{2+}</math>, Ni<math>^{2+}</math>, Fe<math>^{2+}</math>, Mg<math>^{2+}</math>, Zn<math>^{2+}</math>. Bare Cu<math>^{2+}</math> og Zn<math>^{2+}</math> ga noe som helst utslag, og Zn<math>^{2+}</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner (se figur 6). Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^{2+}</math> til løsningen, vil Hg<math>^{2+}</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix (se figur 7). Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^{2+}</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^{2+}</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Figur 8: Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^{2+}</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^{2+}</math> (se figur 8). TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|center|Figur 7: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener<ref name="antigen">Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005</ref>. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 8).
[[Bilde:gen.JPG|350px|left|thumb|Tabell 1: Fem forskjellige oligonukletider]]
[[Bilde:gen2.JPG|300px|center|thumb|Figur 8: Syntese av hybridmolekyler]]

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 9.
[[Bilde:gen3.JPG|300px|center|thumb|Figur 9: Hybridmolekyl med antistoff og antigen]]

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 10). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.
[[Bilde:gen4.JPG|400px|center|thumb|Figur 10: Hybridmolekylet blir bundet til en overflate, og det blir laget flere lag med nanopartikler.]]

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 11 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.
[[Bilde:gen5.JPG|400px|center|thumb|Figur 11: Histogram over abosbering av elektromagnetisk stråling ved difunksjonelle hybdridmolekyler (svarte søyler) og monofunksjonelle hybridmolekyler (grå søyler).]]

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.
[[Bilde:phmeter.JPG|200px|left|thumb|Figur 9: skjematisk figur av I-motif- DNA.]]

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.
[[Bilde:phmeter2.JPG|400px|center|thumb|Figur 8: A: skjematisk figur av prosessen med nanopartikler og I-motif DNA, B: fargeendring i pH-området 5.00-8.00]]

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-31T15:35:47Z

Ingrhal: /* Detektering av antigener */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin)<ref name="bio">Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006</ref>. To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, kan man kontrollere sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder for å lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^{2+}</math>), kobber (Cu<math>^{2+}</math>) og kvikksølv (Hg<math>^{2+}</math>). Alle disse tre bruker litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. . I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^{2+}</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E) (se figur 4). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner, hvis det skulle være ønskelig.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|Figur 4 A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|Figur 5: A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Figur 6: Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2) (se figur 5). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^{2+}</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^{2+}</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^{2+}</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^{2+}</math>, Sr<math>^{2+}</math>, Ni<math>^{2+}</math>, Fe<math>^{2+}</math>, Mg<math>^{2+}</math>, Zn<math>^{2+}</math>. Bare Cu<math>^{2+}</math> og Zn<math>^{2+}</math> ga noe som helst utslag, og Zn<math>^{2+}</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner (se figur 6). Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Figur 7: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^{2+}</math> til løsningen, vil Hg<math>^{2+}</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix (se figur 7). Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^{2+}</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^{2+}</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Figur 8: Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^{2+}</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^{2+}</math> (se figur 8). TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener<ref name="antigen">Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005</ref>. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 8).
[[Bilde:gen.JPG|350px|left|thumb|Tabell 1: Fem forskjellige oligonukletider]]
[[Bilde:gen2.JPG|300px|center|thumb|Figur 8: Syntese av hybridmolekyler]]

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 9.
[[Bilde:gen3.JPG|300px|center|thumb|Figur 9: Hybridmolekyl med antistoff og antigen]]

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 10). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.
[[Bilde:gen4.JPG|400px|center|thumb|Figur 10: Hybridmolekylet blir bundet til en overflate, og det blir laget flere lag med nanopartikler.]]

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 11 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.
[[Bilde:gen5.JPG|400px|center|thumb|Figur 11: Histogram over abosbering av elektromagnetisk stråling ved difunksjonelle hybdridmolekyler (svarte søyler) og monofunksjonelle hybridmolekyler (grå søyler).]]

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.
[[Bilde:phmeter.JPG|200px|left|thumb|Figur 9: skjematisk figur av I-motif- DNA.]]

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.
[[Bilde:phmeter2.JPG|400px|center|thumb|Figur 8: A: skjematisk figur av prosessen med nanopartikler og I-motif DNA, B: fargeendring i pH-området 5.00-8.00]]

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-31T15:24:45Z

Ingrhal: /* Kolorimetrisk pH-meter */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin)<ref name="bio">Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006</ref>. To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, kan man kontrollere sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder for å lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^{2+}</math>), kobber (Cu<math>^{2+}</math>) og kvikksølv (Hg<math>^{2+}</math>). Alle disse tre bruker litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. . I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^{2+}</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E) (se figur 4). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner, hvis det skulle være ønskelig.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|Figur 4 A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|Figur 5: A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Figur 6: Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2) (se figur 5). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^{2+}</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^{2+}</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^{2+}</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^{2+}</math>, Sr<math>^{2+}</math>, Ni<math>^{2+}</math>, Fe<math>^{2+}</math>, Mg<math>^{2+}</math>, Zn<math>^{2+}</math>. Bare Cu<math>^{2+}</math> og Zn<math>^{2+}</math> ga noe som helst utslag, og Zn<math>^{2+}</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner (se figur 6). Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Figur 7: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^{2+}</math> til løsningen, vil Hg<math>^{2+}</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix (se figur 7). Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^{2+}</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^{2+}</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Figur 8: Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^{2+}</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^{2+}</math> (se figur 8). TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.
[[Bilde:phmeter.JPG|200px|left|thumb|Figur 9: skjematisk figur av I-motif- DNA.]]

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.
[[Bilde:phmeter2.JPG|400px|center|thumb|Figur 8: A: skjematisk figur av prosessen med nanopartikler og I-motif DNA, B: fargeendring i pH-området 5.00-8.00]]

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-31T15:23:27Z

Ingrhal: /* Kolorimetrisk pH-meter */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin)<ref name="bio">Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006</ref>. To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, kan man kontrollere sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder for å lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^{2+}</math>), kobber (Cu<math>^{2+}</math>) og kvikksølv (Hg<math>^{2+}</math>). Alle disse tre bruker litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. . I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^{2+}</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E) (se figur 4). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner, hvis det skulle være ønskelig.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|Figur 4 A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|Figur 5: A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Figur 6: Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2) (se figur 5). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^{2+}</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^{2+}</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^{2+}</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^{2+}</math>, Sr<math>^{2+}</math>, Ni<math>^{2+}</math>, Fe<math>^{2+}</math>, Mg<math>^{2+}</math>, Zn<math>^{2+}</math>. Bare Cu<math>^{2+}</math> og Zn<math>^{2+}</math> ga noe som helst utslag, og Zn<math>^{2+}</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner (se figur 6). Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Figur 7: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^{2+}</math> til løsningen, vil Hg<math>^{2+}</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix (se figur 7). Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^{2+}</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^{2+}</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Figur 8: Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^{2+}</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^{2+}</math> (se figur 8). TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.
[[Bilde:phmeter.JPG|200px|left|thumb|Figur 9: skjematisk figur av I-motif- DNA.]]

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.
[[Bilde:phmeter2.JPG|400px|center|thumb|Figur 8: A: skjematisk figur av prosessen, B: fargeendring i pH-området 6.00-7.20]]

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T23:27:20Z

Ingrhal: /* Metallionsensorer */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, kan man kontrollere sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder for å lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^{2+}</math>), kobber (Cu<math>^{2+}</math>) og kvikksølv (Hg<math>^{2+}</math>). Alle disse tre bruker litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. . I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^{2+}</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E) (se figur 4). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner, hvis det skulle være ønskelig.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|Figur 4 A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|Figur 5: A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Figur 6: Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2) (se figur 5). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^{2+}</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^{2+}</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^{2+}</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^{2+}</math>, Sr<math>^{2+}</math>, Ni<math>^{2+}</math>, Fe<math>^{2+}</math>, Mg<math>^{2+}</math>, Zn<math>^{2+}</math>. Bare Cu<math>^{2+}</math> og Zn<math>^{2+}</math> ga noe som helst utslag, og Zn<math>^{2+}</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner (se figur 6). Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Figur 7: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^{2+}</math> til løsningen, vil Hg<math>^{2+}</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix (se figur 7). Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^{2+}</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^{2+}</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Figur 8: Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^{2+}</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^{2+}</math> (se figur 8). TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T23:11:56Z

Ingrhal: /* Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, kan man kontrollere sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder for å lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T23:11:20Z

Ingrhal: /* Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, kan man kontrollere sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T17:08:45Z

Ingrhal: /* Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler */

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|center|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T17:07:13Z

Ingrhal:

Artikkel fra literaturprosjekt i [[TFY4335 - Bionanovitenskap]] våren 2009. Artikkelen fokuserer på hvordan man kan lage sensorer basert på hybridpartikler av DNA og nanopartikler, og ser på endel applikasjoner av disse sensorene. (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

== Innledning - Hvorfor bruke DNA og nanopartikler? ==
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=== DNA-molekylet og dets egenskaper ===
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=== Metallnanopartikler og deres egenskaper ===
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=== Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler ===
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

== Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler ==

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

== Applikasjoner ==
=== Metallionsensorer ===
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

==== Blysensor: ====
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

==== Kobbersensor: ====
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

==== Kvikksølvsensor: ====
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=== Detektering av antigener ===
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

=== Kolorimetrisk pH-meter ===

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T16:56:14Z

Ingrhal: /* Kilder */

=Innledning=
(NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

=Kolorimetrisk pH-meter=

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> </ref> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

== Kilder ==

<references/>

[[Kategori:Prosjekt i Bionanovitenskap]]

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T16:52:44Z

Ingrhal: /* Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler */

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T16:49:25Z

Ingrhal: /* Kolorimetrisk pH-meter */

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T16:48:20Z

Ingrhal: /* Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler */

=Innledning=
(NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. <ref name="buttner"> ]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006 </ref>
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater<ref name="huo">Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006 </ref> <ref name="petrina"> Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006 </ref>. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

=Kolorimetrisk pH-meter=

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006

[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006

[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006

4

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T16:43:48Z

Ingrhal: /* Metallionsensorer */

=Innledning=
(NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. [8]
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater [6,7]. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="Lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

=Kolorimetrisk pH-meter=

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006

[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006

[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006

4

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T16:42:56Z

Ingrhal: /* Metallionsensorer */

=Innledning=
(NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. [8]
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater [6,7]. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade <ref name="Lee">Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007 </ref>. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer <ref name="liu"> Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004 </ref> <ref name="liu2"> Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004 </ref>. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport <ref name="liuli"> Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007 </ref> ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten <ref name="liuli"> </ref> konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren <ref name="lee"> </ref>. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

=Kolorimetrisk pH-meter=

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006

[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006

[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006

4

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T16:35:45Z

Ingrhal: /* Kolorimetrisk pH-meter */

=Innledning=
(NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. [8]
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater [6,7]. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

=Kolorimetrisk pH-meter=

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006

[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006

[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006

4

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T16:34:40Z

Ingrhal: /* Kolorimetrisk pH-meter */

=Innledning=
(NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. [8]
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater [6,7]. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

==Kolorimetrisk pH-meter==

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket <ref name="chen"> </ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006

[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006

[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006

[8]Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004

[9]Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004

[10]Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007

[11]Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007
4

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T16:33:25Z

Ingrhal: /* Kolorimetrisk pH-meter */

=Innledning=
(NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. [8]
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater [6,7]. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

==Kolorimetrisk pH-meter==

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008 <ref name="chen"> Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008 </ref>. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle med denne sensoren er at de bruker umodifiserte GNP, dvs at partiklene er bundet til DNA med elektrostastiske krefter, ikke kovalentbindinger, som vi har sett på tidligere. I dette forsøket har partiklene adsorbert et skall av citrat rundt seg, slik at de blir negativt ladede. Slike negativt ladede GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at de binder seg til ssDNA, men ikke dsDNA <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Dette er fordi i dsDNA ligger alle basene inne i dobbelhelixstrukturen, og «viser» dermed bare den negative ladede fosforrygggraden. Vi vil dermed får frastøting mellom dsDNA og GNP. I ssDNA ligger basene like eksponert som fosforgruppene, vi får dermed tiltrekkende krefter mellom DNAet og GNP. I en løsning med ssDNA vil vi altså få hybrid partikler som hindres i å sammenklumpes, mens i en løsning med dsDNA vil vi få sammenklumpede GNP.

I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="phan">Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix</ref> <ref name"jin">Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
</ref> . Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket <ref name"chen"></ref> går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten <ref name="chen"> </ref> brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer. <ref name="Liu"> Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007 </ref>

I følge artikkelen <ref name="chen"> vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006

[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006

[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006

[8]Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004

[9]Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004

[10]Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007

[11]Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007

[12]Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008

[13]Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007

[14]Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix

[15]Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009

[16]Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-28T16:21:20Z

Ingrhal: /* Kolorimetrisk pH-meter */

=Innledning=
(NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)

I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. [8]
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater [6,7]. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

==Kolorimetrisk pH-meter==

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle ved denne senoren er at den bruker umodifiserte gullnanopartikler, i motsetning til det vi har sett på tidligere. Umodifiserte GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at GNP binder seg til ssDNA, og dermed hindrer aggregering. I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH-sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø <ref name="li"> Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004 </ref>. Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer.

I følge artikkelen vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006

[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006

[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006

[8]Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004

[9]Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004

[10]Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007

[11]Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007

[12]Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008

[13]Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007

[14]Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix

[15]Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009

[16]Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-17T16:11:18Z

Ingrhal: /* Kvikksølvsensor: */

=Innledning=
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. [8]
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater [6,7]. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|left|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

==Kolorimetrisk pH-meter==

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle ved denne senoren er at den bruker umodifiserte gullnanopartikler, i motsetning til det vi har sett på tidligere. Umodifiserte GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at GNP binder seg til ssDNA, og dermed hindrer aggregering. I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø. Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer.

I følge artikkelen vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006

[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006

[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006

[8]Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004

[9]Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004

[10]Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007

[11]Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007

[12]Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008

[13]Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007

[14]Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix

[15]Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009

[16]Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-17T16:10:54Z

Ingrhal: /* Kvikksølvsensor: */

=Innledning=
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. [8]
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater [6,7]. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|center|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

==Kolorimetrisk pH-meter==

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle ved denne senoren er at den bruker umodifiserte gullnanopartikler, i motsetning til det vi har sett på tidligere. Umodifiserte GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at GNP binder seg til ssDNA, og dermed hindrer aggregering. I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø. Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer.

I følge artikkelen vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006

[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006

[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006

[8]Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004

[9]Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004

[10]Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007

[11]Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007

[12]Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008

[13]Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007

[14]Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix

[15]Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009

[16]Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-17T16:09:45Z

Ingrhal: /* Kobbersensor: */

=Innledning=
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. [8]
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater [6,7]. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|right|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

En gruppe forskere har forsket på denne sensoren. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.
[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

==Kolorimetrisk pH-meter==

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle ved denne senoren er at den bruker umodifiserte gullnanopartikler, i motsetning til det vi har sett på tidligere. Umodifiserte GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at GNP binder seg til ssDNA, og dermed hindrer aggregering. I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø. Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer.

I følge artikkelen vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006

[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006

[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006

[8]Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004

[9]Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004

[10]Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007

[11]Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007

[12]Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008

[13]Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007

[14]Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix

[15]Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009

[16]Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-17T16:06:33Z

Ingrhal: /* Blysensor: */

=Innledning=
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. [8]
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater [6,7]. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|center|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol). De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.
[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|right|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

En gruppe forskere har forsket på denne sensoren. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.
[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

==Kolorimetrisk pH-meter==

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle ved denne senoren er at den bruker umodifiserte gullnanopartikler, i motsetning til det vi har sett på tidligere. Umodifiserte GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at GNP binder seg til ssDNA, og dermed hindrer aggregering. I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø. Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer.

I følge artikkelen vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006

[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006

[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006

[8]Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004

[9]Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004

[10]Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007

[11]Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007

[12]Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008

[13]Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007

[14]Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix

[15]Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009

[16]Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004

Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler

2009-03-17T16:05:51Z

Ingrhal: /* Blysensor: */

=Innledning=
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.

=DNA-molekylet og dets egenskaper=
[[Bilde:dna1.jpg|350px|thumb|right|FIGUR 1: Et DNA-molekyl består av to sammenbundede strenger av nukleotider. Et nukleotid består av en nitrogenholdig base,sukker (D-ribose eller 2-deoxy-D-ribose) og en fosfatgruppe.]]
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.

DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.

=Metallnanopartikler og deres egenskaper=
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.

=Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler=
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.

Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.

Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. [8]
Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater [6,7]. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.

=Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler=

I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring. [[Bilde:dna2.jpg|500px|thumb|center|FIGUR 2: Sammenklumping av DNA-gullnanopartikler ved tilsetting av target DNA.]]

[[Bilde:dna3.jpg|400px|thumb|right|FIGUR 3: Satellittsystem av gullnanopartikler med forskjellig størrelse.]]
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).

Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.

=Metallionsensorer=
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.

Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.

===Blysensor:===
[[Bilde:blysensor.JPG|400px|right|thumb|A: Substrattråden 17DS og enzymtråden 17E, vist med RNA-binding, B: Kløyvingen ved hjelp av blyioner, C: Hele prossessen som fører til fargeforandring ved tilsatte blyioner]]
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly.
Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.

===Kobbersensor:===
[[Bilde:kobbersensor.JPG|300px|right|thumb|A: To DNA-tråder S1 og S2 bindes sammen ved hjelp av enzyme ligase E47, B: Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeforandring]]
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.

Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol). De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.
[[Bilde:kobbersensor2.JPG|200px|left|thumb|Adsorpsjon som en funksjon av kobber og sinkkonsentrasjon]]

===Kvikksølvsensor:===
[[Bilde:kvikksølvsensor.JPG|400px|thumb|right|Skjematisk bilde av prosessen som fører til fargeendring ved tilsats av kvikksølvioner]]
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.

En gruppe forskere har forsket på denne sensoren. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.
[[Bilde:kvikksølv3.JPG|200px|left|thumb|Lineær sammenheng mellom <math>T_M</math> og konsentrasjon av kvikksølv]]

=Detektering av antigener=
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.

Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.

Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).

Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.

Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.

Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.

==Kolorimetrisk pH-meter==

Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle ved denne senoren er at den bruker umodifiserte gullnanopartikler, i motsetning til det vi har sett på tidligere. Umodifiserte GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at GNP binder seg til ssDNA, og dermed hindrer aggregering. I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø. Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.

Forsøket går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.

I denne rapporten brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer.

I følge artikkelen vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.

==Kilder==

[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005

[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006

[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005

[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004

[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006

[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006

[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006

[8]Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004

[9]Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004

[10]Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007

[11]Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007

[12]Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008

[13]Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007

[14]Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix

[15]Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009

[16]Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004