Forskjell mellom versjoner av «Sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler»
(→Kvikksølvsensor:) |
(→Innledning) |
||
| Linje 1: | Linje 1: | ||
=Innledning= |
=Innledning= |
||
| + | (NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!) |
||
| ⚫ | I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering. |
||
| ⚫ | I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering. |
||
=DNA-molekylet og dets egenskaper= |
=DNA-molekylet og dets egenskaper= |
||
Revisjonen fra 18. mar. 2009 kl. 20:34
Innhold
Innledning
(NB! Artikkelen er ikke ferdigskrevet ennå!)
I tillegg til inhibitor- og katalysatoregenskaper, har biomaterialer en unik gjenkjennelses- evne som viser seg blant annet i vekselvirkningen mellom antigen og antistoff, og mellom komplementære nukleinsyrer. Nanopartikler av metaller og halvledere har på den annen side elektroniske, optiske og kjemiske egenskaper som skiller seg fra partikler i bulk. Ved å kombinere egenskapene til biomaterialer og nanopartikler i spesielle hybridpartikler, er det mulig å å finne, organisere og montere nanokomponenter etter bottom-up-prinsippet. Denne artikkelen fokuserer på sensorer basert på sammenklumping av DNA-nanopartikler - teknologi som vil bli viktig i alt fra medisin og genforskning til metalldetektering.
DNA-molekylet og dets egenskaper
Deoxyribonukleinsyre (DNA) er et molekyl – eller rettere sagt et dobbeltmolekyl - som inneholder kroppens arvemateriale. En enkeltstreng av DNA (ssDNA) består av en ryggmarg av sukker- og fosfatgrupper, kodet med fire forskjellige nitrogenholdige baser (Adenin, Tymin, Guanin og Cytosin). To og to av disse basene er komplementære, noe som betyr at A kun kan danne binding med T, og at C kun kan binde seg til G. Dobbeltsttrenget DNA – dsDNA - består av to komplementære DNA-strenger som er bundet sammen i en spiralform; en såkalt dobbelhelix. En DNA streng på under 20 baser kalles et oligonukletid. Rekkefølgen til basene fungerer som en oppskrift for å bygge opp proteiner, og oppskriften på ett protein kalles et gen.
DNA-molekylet er svært stabilt siden strengene holdes sammen av hydrogenbindinger mellom komplementære baser; to og tre hydrogenbindinger mellom henholvsvis A-T og C-G. Det er denne stabiliteten samt selektiviteten i reaksjonsmønsteret til basene vi ønsker å utnytte. Ved å utstyre nanopartikler med ssDNA, kan vi utnytte DNA-ets tendens til å binde seg til komplementære strenger, og skape selvorganisering av nanopartikler. Med moderne bioteknologi har vi god kontroll over syntetiseringen av DNA-strenger. Lett tilgjengelige kjemiske og biologiske midler gjør det mulig å kontrollere både lengde og sammensetning til nukleinsyrene. De kan også lett kopieres, og spesielle enzymer kan brukes for å katalysere manipuleringen. I kroppen brukes også DNA som katalysatorer av diverse reaksjoner. Denne typen DNA kaller vi DNAzymes. DNAzymes har en enorm gjenkjennelsesevne, som vi kan dra nytte av til å manipulere spesifikke reaksjoner.
Metallnanopartikler og deres egenskaper
Metallnanopartikler og nanopartikler generelt skiller seg fra partikler i bulk ved at de har andre kjemiske, elektriske og optiske egenskaper. For eksempel har nanopartikler andre løselighetsegenskaper følge av at andelen overflatemolekyler er større enn for partikler i bulk, mens inaktive metaller som gull blir halvledere med katalysatoregenskaper grunnet en redusering i tilstandstettheten. Det er imidlertid først og fremst de endrede optiske egenskapene vi er interessert i når vi skal utvikle sensorer basert på nanopartikler. Nanopartikler har en annen farge enn partikler i bulk som følge av en effekt som kalles overflateplasmonresonans (surface plasmon resonance; SPR). Når partikler blir mye mindre enn lysets bølgelengde, vil lyset føre til en koherent oscillering av elektronene i konduksjonsbånde. noe som fører til endringer i absorpsjonsspekteret. For gull fører dette til en fargeforandring fra gull til rødt, via blått og lilla. De optiske egenskapene til nettverket bestemmes i stor grad av lengden på DNA-oligonukleotidene som forbinder nanopartiklene. Denne lengden bestemmer ikke bare avstanden mellom partiklene, men også aggregeringshastigheten, og dermed antall nanopartikler per aggregat. At fargen til nanopartikler avhenger av avstanden mellom dem, åpner mulighetene for kolorimetriske sensorer basert på sammenklumping. Siden vi kan kontrollere størrelsen til nanopartikler, kan vi også bestemme hvordan partiklene skal fungere som sensorer.
Syntese av DNA-funksjonaliserte gullnanopartikler
Siden vi er i stand til å kontrollere både lengden og sammensetningen til nukleinsyrer, åpner det for muligheten til å sammenklumpingen av nanopartikler ved å utstyre de med DNA-strenger. På den måten kan vi bestemme både avstanden mellom partiklene og hvordan de er ordnet i rommet. Lange oligonukleider fungerer som støpeformer, og kan ta imot nanopartikler med komplementære basepar der vi ønsker å plassere dem.
Det finnes flere forskjellige metoder lage DNA-nanopartikkel-hybrider. De simpleste metodene baserer seg på adsorpsjon av funksjonelle grupper på overflaten av partiklene. Da kan man for eksemple bruke elektrostatiske krefter for å binde de to sammen. Negativt ladet DNA vil for eksempel binde seg til postivt ladede partikler, som Cd<math>^{2+}</math> rike CdS-partikler. Dette kalles ofte umodifiserte GNP, siden man ikke trenger å gjøre noe med selve partikkelen.
Man kan også bruke thiolfunksjonaliserte molekyler. Thiol vil adsoberes på metalloverflater, og lage kovalente bindinger. Disse bindingene resulteres av et positivt bindingsenergi-skift i metallet, som blir sterkere jo mindre partikler man har. [8] Noen mer kompliserte metoder er å bruke forskjellige beskyttende skall rundt nanopartikkelen. Disse skallene kan da bindes til de funksjonelle gruppene man vil ha. Slike skall kan være organiske skall, polymerer eller citrater [6,7]. Disse metodene er gode for å få monofunksjonelle partikler, altså at det bare bindes en type funksjonell gruppe til partikkelen.
Kontrollert sammenklumping av DNA-modifiserte nanopartikler
I et forsøk som demonstrerte den DNA-styrte sammenklumpingen av nanopartikler, ble to partier gullnanopartikler – 13 nm i diameter – hver for seg utstyrt med henholvsvis 3’-thiol-TACCGTTG-5’ og 5’-AGTCGTTT-3’-thiol, altså to ikke-komplementære thiol-oligonukleotider. Så konstruerte man et såkalt target DNA; et molekyl bestående av dsDNA i midten og ss-DNA i endene. Slike enkeltstrengete ender kalles ofte «sticky ends». Endene var komplementære til oligonukleotidene på de to partiene med gullnanopartikler. Target DNAet ble tilsatt en blanding av de to hybridmolekylene, noe som resulterte i at partiklene klumpet seg sammen (figur 2). Som følge av SPR ble det i løsningen observert en fargeforandring fra rødt til blått. I et kontrolleksperiment ble et ikke-komplementært target DNA-molekyl tilsatt løsningen, og da ble det som ventet ikke observert noen fargeforandring.
Siden nanopartiklene som ble brukt i dette forsøket var like av størrelse, var det ikke mulig å observere det faste mønsteret som i følge teorien skulle dannes når partiklene klumpet seg sammen. Forsøket ble derfor gjentatt med en blanding av gullnanopartikler av ulik størrellse (40 nm og 5 nm i diameter). Resultatet ble at mange små nanopartikler klumpet seg rundt de store nanopartiklene i et tredimensjonalt satellittsystem (figur 3).
Nanopartiklenes tendens til å forandre optiske og elektriske egenskaper når de klumper seg sammen, gjør det mulig å overvåke aggregeringsprosessen, og vi har dermed utgangspunktet for en optisk DNA-biosensor.
Metallionsensorer
En applikasjon for sensorer basert på DNAfunksjonaliserte gullnanopartikler, er deteksjon av metallioner. Å lage gode sensorer for metallioner er svært viktig, da mange av disse ionene kan være giftige og skadelige for mennesker. Kvikksølv er for eksempel kreftfremkallende, og kan føre til permanent hjerneskade. Metallionsensorer kan brukes både som et prevantivt middel, ved å detektere metallionene i forskjellige produkter (for eksempler maling) eller i drikkevann, og som et medisinsk middel, for å sjekke konsentrasjonen av disse ionene i kroppen.
Vi skal her ta for oss tre eksempler på metallionesensorer; Bly (Pb<math>^2+</math>), kobber (Cu<math>^2+</math>) og kvikksølv (Hg<math>^2+</math>). Alle disse tre brukerr litt forskjellige metoder, men grunntanken går ut på at spesifikke metallioner har en svært høy affinitet til spesielle DNAsekvenser. I blysensoren bruker man at bly kløyver et spesielt DNAzyme, mens i kobbersensoren bruker man et kobberavhengig enzym (et spesielt ligase-enzym) som binder to DNAtråder til hverandre. DNAzyme er DNA som ikke bare inneholder genetisk informasjon, men som også er en katalytisk aktiv komponent i kroppen. I kvikksølvsensoren bruker man at kvikksølv binder to tymingrupper sammen.
Blysensor:
Blyioner (Pb<math>^2+</math>) har vist høy affinitet til et DNAzyme kalt «8-17» DNAzyme, dette DNA enzymet har i flere uavhengige forskningsprosjekt blitt brukt til å lage blysensorer. «8-17» DNA-zymet inneholder en substrattråd (17DS) og en enzymtråd (17E). Substrattråden er for det meste en ren DNAkjede, men med en liten «feil», den har en enkelt RNA-binding (rA). Denne bindingen blir delt i to ved nærvær av blyioner. Denne splittingen kan utnyttes når vi skal detektere bly. Vi bruker gullnanopartikler som er funksjonalisert med oligonukletider. De komplementære trådene til GNP-oligonukletidene festes til substrattråden som «sticky ends». Dermed vil komplementære oligonukletider på GNP og substrattåden kunne binde seg sammen. Hver GNP er funksjonalisert med flere oligonukletider, og vil dermed kunne feste seg til flere sticky ends samtidig. Vi får altså en fastbundet tredimensjonal struktur av DNAzymes og GNP. Man blander altså «8-17» DNAzyme med utvidete sticky ends og funksjonaliserte GNP; og får en aggregert løsning med blå farge. Hvis man da tilsetter bly vil RNA bindingene kløyves, og strukturen vil løses opp så vi får frie GNP. Løsningen vil altså skifte farge til rød. Gjør man det samme uten blyioner tilstede vil man ikke kunne detektere noen fargeendring. En slik type sensor kan oppdage konsentrasjoner på mellom 0,1 og 4 mikromol. Ved å tilsette inaktive DNA, kan man forandre konsentrasjonsområdet med flere størrelsesordner.
Kobbersensor:
I denne sensorer brukes et DNAzyme som bindende middel i stedet for kløyving. Metallionet fører altså til en binding mellom to DNAtråder, i stedet for en splitting som vi så i blydetektoren. Dette er fordi vi bruker et spesielt DNA enzym som katalyserer bindingen mellom to tråder i replikasjonen av DNA (ligaseenzym). Dette ligaseenzymet (E47) er avhengig av å ha kobber (Cu<math>^2+</math>) tilstede for å virke, og det er denne funksjonen vi bruker i sensoren.
Vi bruker GNP som er funksjonalisert med to forskjellige DNAtråder (S1 og S2). En av de to trådene er aktivert med imidazole, som er et fosformolekyl. De to forskjellige DNA-trådene kan bindes sammen ved nuklifilt angrep på fosforgruppen av hydroksylgruppen i den andre tråden. Denne reaksjonen blir katalysert av Cu<math>^2+</math> og ligase enzymet (E47). Ved å tilsette Cu<math>^2+</math> får vi altså en struktur av bundne GNP, og dermed fargeendring fra rød til blå. I en forskningsrapport ble denne sensorteknikken utprøvd. De brukte både kolometri og smeltetemperatur for å validere resultatene. De fant da at man må ha konsentrasjoner fra 5 mikromol Cu<math>^2+</math> i løsningen, for å få utslag på sensoren. Dette er mer enn bra nok for å teste konsentrasjoner i drikkevann (bør ikke være over 20 mikromol).De testet også andre lignende metallioner som Ba<math>^2+</math>, Sr<math>^2+</math>, Ni<math>^2+</math>, Fe<math>^2+</math>, Mg<math>^2+</math>, Zn<math>^2+</math>. Bare Cu<math>^2+</math> og Zn2+ ga noe som helst utslag, og Zn<math>^2+</math> ga bare utslag ved svært høye konsentrasjoner. Forskningsrapporten konkluderte med at dette var en lett og enkel sensor, som kunne forbedres ved en nøyere utvelging av DNA-trådene brukt i forsøket.
Kvikksølvsensor:
Sånn som i kobbersensoren bruker man også her gull nanopartikler som er funksjonalisert med to forskjellige oligonukeltider. Siden det er vist at kvikksølv har en høy affinitet til thymin-thymin bindinger, bruker man oligonukletider som er komplementære til hverandre, men unntak av et sted, der vi har en T-T mismatch. Hvis vi tilsetter Hg<math>^2+</math> til løsningen, vil Hg<math>^2+</math> virke som et slags lim ved T-T-bindingen, så de to trådene kan binde seg sammen, som en vanlig dobbelhelix. Gull nanopartikler i en slik DNA-struktur har høyere smeltetemperatur (ca. 10 grader), i forhold til når de er frie. Tilsetting av Hg<math>^2+</math> vil altså føre til at oligonukletidene bindes sammen, og smeltetemperaturen (Tm) økes. Når vi varmer opp blandingen vil gull partiklene rive seg løs og vi vil se en skarp fargeendring fra lilla til rød. Hvis vi varmer opp en blanding med Hg<math>^2+</math> og en uten, vil vi se at denne fargeendringen skjer ved forskjellig temperatur. Strukturen stabiliserer altså blandingen.
En gruppe forskere har forsket på denne sensoren. Uten Hg<math>^2+</math> smelter blandingen ved 46 grader, og har da en skarp lilla til rød fargeforandring. Med Hg<math>^2+</math> får vi samme fargeforandring ved en høyere temperatur. Denne økningen i temperatur er lineær med konsentrasjonen av Hg<math>^2+</math>. TM øker med 5 grader for en økning i konsentrasjon på 1 mikromol. Sensoren har en spesifikkhet på 100nmol, noe som er bedre enn alle andre tidligere kolometriske Hg2+sensorer.
Detektering av antigener
DNA-nanopartikler har vist seg å være et allsidig verktøy for å analysere ikke bare nukleinsyrer og metallioner, men også proteiner. En gruppe forskere har nylig tatt i bruk DNA-gullnanopartikler bestående av to forskjellige oligonukleid-sekvenser for å detektere antigener. Antigener er molekyler – gjerne proteiner – som finnes på overflaten av blant annet virus og bakterier. Disse starter kroppens produksjon av antistoff for å gjenkjenne og nøytralisere inntrengere. Metoden som beskrives her er derfor ventet å få stor betydning innen immunologi og analyse av proteiner generelt.
Vanligvis har DNA-nanopartikler som blir brukt i sensorer, kun bestått av én type DNA-sekvens på hver nanopartikkel, såkalte monofunksjonelle nanopartikler. Ny teknologi har imidlertid gjort det mulig å fremstille oligofunksjonelle nanopartikler bestående av fra to (difunksjonelle) til sju (heptafunksjonelle) DNA-sekvenser. Den nevnte forskergruppen fant en måte å utnytte difunksjonaliteten til å oppnå svært sensitiv detektering av antigen-proteiner.
Første steg var å syntetisere de difunksjonelle gullnanopartiklene fra thiolisert ss-DNA ved adsorpsjon. Fem forskjellige oligonukleotider (nummer 1-5 i tabellen under) ble brukt til å syntetisere tre forskjellige difunksjonelle hybrider (figur 4).
Antistoff rettet mot antigenet immunoglobulin G fra mus ble så bundet til en DNA-streng blant annet ved hjelp av proteinet streptavidin (STA) og biotin. DNA-strengen var komplementær til den ene typen DNA-strenger på molekyl nummer 1 på figuren. På den måten fikk man dannet et nytt hybridmolekyl; nummer 4 på figur 5.
Dette hybridmolekylet ble deretter brukt som reagent for å merke antistoffets antigen som var bundet til overflaten i en av brønnene i en mikrotiterplate ved hjelp av spesielle antistoffer. Deretter ble en blanding av forbindelse 2 og 3 sammen med to forskjellige DNA-lenker (8 og 9) tilsatt for å danne multilayers av gullnanopartikler. Target molekyl 8 fungerte som immobilisator, mens molekyl 9 skapte sammenklumping (figur 6). På denne måten ble det enklere å detektere antigenene ved hjelp av UV/VIS-spektroskopi. I tillegg er bruken av difunksjonelle i stedet for monofunksjonelle nanopartikler tidsbesparende, fordi man kan tilsette alle reagentene samtidig.
Spektroskopiske målinger av absorberingen av elektromagnetisk stråling med 540 nm bølgelengde demonstrerte en klar forbedring i sensitiviteten ved å bruke difunksjonelle nanopartikler i stedet for monofunksjonelle. Histogrammet i figur 7 viser dette tydelig. De svarte søylene viser signalet ved bruk av to forskjellige difunksjonelle hybridmolekyler. Med denne teknikken fikk man signal ved så lave konsentrasjoner av antigen som 0.1 fmol i en brønn med 50 mikroliter løsning, dvs 10-9 M.
Kolorimetrisk pH-meter
Et siste eksempel på bruk av DNA baserte sensorer kommer fra en forskningsrapport fra oktober 2008. Her viser man en helt ny metode for å utvikle optiske pH-sensorer. Det spesielle ved denne senoren er at den bruker umodifiserte gullnanopartikler, i motsetning til det vi har sett på tidligere. Umodifiserte GNP kan skille mellom ssDNA og dsDNA, ved at GNP binder seg til ssDNA, og dermed hindrer aggregering. I tillegg til denne egenskapen bruker forskerne her en helt spesiell type DNA, I-motif DNA, som er pH sensitiv. Denne typen DNA skifter struktur ved skiftende pH, og går fra en firetrådet struktur i surt miljø, til en løs enkelttrådet struktur i basisk miljø. Ved å kombinere I-motif DNA og umodifiserte gull nanopartikler har forskerne klart å lage et nytt og mer sensitivt pH-meter.
Forsøket går ut på å blande umodifiserte GNP med I-motif DNA i en løsning. Hvis løsningen er sur, vil I-motif DNAet være i en rigid struktur, og gullpartiklene kan ikke binde seg. GNP vil dermed klumpe seg sammen og løsningen vil ha en rødlig farge. Øker vi pHen vil vi se et gradvis skille der fargen går fra rød til blå. Dette er fordi i mer basiske løsninger vil DNAet løse opp strukturen sin og til slutt bli et enkelttrådet DNA. Gullpartiklene vil binde seg til DNAet, og vi får en fargeforandring. Å bruke vanlig DNA i dette forsøket vil ikke lage noen fargeforandring, da vanlig DNA ikke forandrer struktur ved forskjellig pH.
I denne rapporten brukte forskerene flere metoder for å teste resultatet, blandt annet UV-Vis spectroscopy og resonance Rayleigh scattering (RRS), som alle ga samme resultat. De brukte pH-området mellom 6.00 og 7.20, og fant at metoden var svært nøyaktig, med en feilmargin på 0.04. Dette er betydelig bedre enn andre optiske nanopartikkel pH-sensorer.
I følge artikkelen vil denne typen sensor ha stor bruksverdi innen biologi, biomedisin, prosesskontroll og nanoteknologi. I tillegg kan denne metoden bli brukt for å finne mer ut om I-motif DNAet.
Kilder
[1]Pompi Hazarika, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Sensitive Detection of Proteins Using Difunctional DNA–Gold Nanoparticles, 2005
[2]Paula Yurkanis Bruice, Essential Organic Chemistry, Pearson International edition 2006
[3]Eugenii Katz and Itamar Willner, Integrated Nanoparticle–Biomolecule Hybrid Systems: Synthesis, Properties, and Applications, 2005
[4]Pompi Hazarika, Tatiana Giorgi, Martina Reibner, Buelent Ceyhan, and Christof M. Niemeyer, Synthesis and Characterization of Deoxyribonucleic, 2004
[5]Qun Huo, James G. Worden, Monofunctional goldparticles; synthesis and application, 2006
[6]Stephanie Petrina, Chemical Crosslinking and Temperature Dependant Conuctivity of Ligand-Stabilized Gold Nanoparticles, NNIN REU 2006
[7]Michel Büttner, Helge Kröger, Inga Gerhards, Daniel Mathys, Peter Oelhafen , Changes in the electronic structure of gold particles upon thiol adsorption as a function of the mean particle size, 2006
[8]Juewen Liu and Yi Lu, Optimization of a Pb2+-Directed Gold Nanoparticle/DNAzyme Assembly and Its Application as a Colorimetric Biosensor for Pb2+, 2004
[9]Juewen Liu and Yi Lu, Accelerated Color Change of Gold Nanoparticles Assembled by DNAzymes for Simple and Fast Colorimetric Pb2+ Detection, 2004
[10]Juewen Liu and Yi Lu, Colorimetric Cu2+ detection with a ligation DNAzyme and nanoparticles, Chem. Commun, 2007
[11]Jae-Seung Lee, Min Su Han, Chad A. Mirkin, Colorimetric Detection of Mercuric Ion (Hg2+) in Aqueous Media using DNA-functionalized Gold Nanoparticles, Angew. Chem. 2007
[12]Cuie Chen, Guangtao Song, Jinsong Ren and Xiaogang Qu, A simple and sensitive colorimetric pH meter based on DNA conformational switch and gold nanoparticle aggregation, 2008
[13]Jaswinder Sharma, Rahul Chhabra, Hao Yan, Yan Liu, pH-driven conformational switch of «i-motif» DNA for the reversible assembly of gold nanoparticles, Chem. Commun. 2007
[14]Anh Tuân Phan and Jean-Louis Mergny, Human telomeric DNA: G-quadruplex, i-motif and Watson–Crick double helix
[15]Kyeong Sik Jin, Su Ryon Shin, Byungcheol Ahn, Yecheol Rho, Seon Jeong Kim and Moonhor Ree, pH-Dependent Structures of an i-Motif DNA in Solution, 2009
[16]Huixiang Li, Lewis Rothberg, Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles, 2004
