Forskjell mellom versjoner av «Avdekking av proteinstruktur»

Revisjonen fra 23. apr. 2009 kl. 18:30

siden er under konstruksjon

Avdekking av proteinstruktur handler om å finne ut hvilken form og oppbygning ulike proteiner har. I løpet av de siste tiårene har det skjedd en rask utvikling i teknologi og metodikk for bestemmelse av proteinstruktur, og disse nyvinningene har gitt avgjørende kunnskap om naturens virkemåte og muligheter. Per i dag er over 52 000 proteiners struktur bestemt og offentliggjort, og i de siste årene har det blitt avdekket mer enn 5 000 nye proteinstrukturer årlig<ref name="xrd_nmr_mest"> http://www.pdb.org/pdb/static.do?p=general_information/pdb_statistics/index.html& </ref>.

Proteiner er biologiske makromolekyler syntetisert fra enkeltmolekyler av aminosyrer<ref name="proteinstruktur"> Bruice PY (2006). Essential Organic Chemistry. Pearson Education Inc. pp. 448-456.</ref>. Syntetiseringen skjer i celleorganeller kalt ribosomer, som igjen veiledes og reguleres av cellekjernens DNA-baserekke. Foldingen av syntetiserte aminosyrekjeder til ferdigdannede tre-dimensjonale proteiner skjer ved et samspill av spontane og enzym-koblede prosesser. Strukturen til proteiner blir gjerne inndelt i primær-, sekundær-, tertiær- og kvartærstruktur. Dette svarer henholdsvis til proteinets aminosyresekvens, repetitive konformasjoner utgjort av proteinets ryggrad, proteinets tre-dimensjonale atomstruktur og individuelle peptidkjeders orientering i forhold til hverandre<ref name="proteinstruktur"> </ref>. I denne artikkelen fokuseres det på proteiners tertiærstruktur, altså deres tre-dimensjonale atomstruktur, og avdekking av disse. Her vil derfor begrepet proteinstruktur bli brukt synonymt med en tre-dimensjonal atommodell av proteinet.

Figur 2: J. C. Kendrew i aksjon med sin atommodell av myoglobin, det første proteinet til å få avdekket sin tre-dimensjonale atomstruktur. Kendrew vant sammen med M. F. Perutz Nobelprisen i kjemi i 1962 for sine strukturstudier av globulære proteiner.

Kilde: © MRC Laboratory of Molecular Biology

Den første proteinstrukturen ble avdekket i 1958<ref name="Lesk_historie"> Lesk AM (2004). Introduction to Protein Science. Oxford University Press. pp. 93-94.</ref>, da J. C. Kendrew og M. F. Perutz hadde funnet strukturen til myoglobin ved hjelp av røntgenkrystallografi. Året etter kunne Perutz publisere strukturen til det enda større proteinet hemoglobin ved hjelp av samme framgangsmåte (Perutz og Kendrew vant i 1962 Nobelprisen i kjemi for dette arbeidet<ref name="Nobelpris"> http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1962/index.html </ref>). Dette ble startskuddet for avdekking av en lang rekke proteinstrukturer funnet ved røntgenkrystallografi. Først i 1980-årene lyktes man i å utvikle en alternativ strukturbestemmelsesmetode for proteiner: nukleær-magnetisk resonans (NMR)<ref name="Lesk_historie"> </ref>. I dag er også noen proteinstrukturer avdekket ved hjelp av ulike varianter av elektronmikroskopi<ref name="Lesk_historie"> </ref>. Røntgenkrystallografi og NMR består imidlertid som de mest brukte teknikkene<ref name="xrd_nmr_mest"> </ref>.

Allerede kjente proteinstrukturer - The Protein Data Bank (PDB)

The Protein Data Bank (PDB) er en internasjonal databank bygget opp av forskere fra hele verden. Databanken oppdateres kontinuerlig, og inneholder nå strukturelle data for over 52 000 proteiner<ref name="pdb"> http://www.pdb.org/pdb/statistics/holdings.do </ref>. Dataene ligger lagret som x-, y-, z-koordinater og annen relevant informasjon for de ulike atomene i proteinet. Denne informasjonen kan for eksempel være konformasjoner for aminosyrene, eller hvilke molekyler de ulike atomene tilhører hvis strukturen består av flere molekyler. Ved hjelp av et dataprogram kan man dermed kikke nærmere på ulike deler av strukturen man studerer og få en bedre forståelse av denne. Slike programmer kan man laste ned gratis; to eksempler er StarBiochem og Jmol.

Strukturbestemmelsesmetoder

Av proteinstrukturene publisert i The Protein Databank, er om lag 87 % avdekket ved hjelp av røntgenkrystallografi og rundt 13 % av strukturene funnet ved bruk av NMR. Det totale bidraget fra alle andre strukturbestemmelsesmetoder til sammen er under 1 %<ref name="pdb"> </ref>. Alternative teknikker til røntgenkrystallografi og NMR er imidlertid ikke uvesentlige, da noen grupper proteiner vanskelig lar seg strukturbestemme verken ved røntgenkrystallografi eller ved NMR. Eksempler på slike er membranproteiner og proteiner av stor størrelse. Da kan lav-temperatur elektronmikroskopi (CryoEM) være et godt alternativ<ref name="Lesk_cryoEM"> Lesk AM (2004). Introduction to Protein Science. Oxford University Press. pp. 98-99.</ref>. Prinsippene for disse mest brukte strukturbestemmelsesmetodene for proteiner er kort gjengitt nedenfor.

Røntgenkrystallografi (X-ray Crystallography)

Fordeler ved røntgenkrystallografi

• Høy oppløsning dersom god krystall

• Takler store proteiner

• Velutviklet utstyr, programvare og teori tilgjengelig

Ulemper ved røntgenkrystallografi

• Krever produksjon av en relativt stor proteinkrystall

• Fungerer ikke for membranproteiner

• Ingen følsomhet overfor proteiners bevegelighet eller forskjellige konformasjoner

Nukleær-magnetisk resonnans (NMR)

Nukleær-magnetisk resonnans (NMR), eller kjernemagnetisk resonans, bygger på mye av det samme prinsippet som benyttes i en MR-undersøkelse.

Atomkjerner som har egenskapen spinn, har også et magnetisk moment<ref name="magnetisk_moment"> Mansfield M, O´Sullivan C (2007). Understanding Physics. John Wiley & Sons. p. 665.</ref>. Hvis en atomkjerne med et magnetisk moment utsettes for et magnetfelt <math>B</math>, vil momentet rotere rundt retningen til magnetfeltets vertikalakse. Det magnetiske momentet vil da rotere med en bestemt frekvens <math>\omega_{0}</math>, Larmor-frekvensen. Denne rotasjonsbevegelsen kalles presesjon. Larmor-frekvensen avhenger av styrken på magnetfeltet og det magnetiske momentet, og er gitt ved<ref name="larmor"> J. C. Edwards. "Principles of NMR"</ref>:

<math>\omega_{0}=\gamma B_{0}</math>

der <math>B</math> er den magnetiske feltstyrken og <math>\gamma</math> er magnetogyrisk ratio, som sier noe om hvor sterk magnetkjernen er.

Dannelse av NMR-spekter

Under et NMR-forsøk utsettes en kjerne for et magnetfelt og radiobølgestråling lik Larmorfrekvensen til kjernen. Hvis et magnetisk moment preseserer med samme frekvens som radiobølgene, vil det magnetiske momentet absorbere energi og endre energitilstand, slik at det dannes kjernemagnetisk resonans. Deretter fjernes strålingen og kjernen vil returnere til den opprinnelige energitilstanden. I denne prosessen emitteres det energi. NMR-spekteret dannes på grunnlag av målinger av den emitterte energien og frekvensene hvor dette skjer.

Hva kan man lese ut ifra et NMR-spekter?

Ulike atomer i et molekyl resonerer med ulike frekvenser ved en gitt feltstyrke. I tillegg vil en variasjon i elektrondistribusjonen rundt et atom gi en variasjon i kjernens magnetiske resonans frekvens. Dette er fordi elektroner skjermer kjernen og dermed endrer det magnetiske feltet rundt atomkjernen. Atomer vil altså resonere med ulik frekvens avhengig av det kjemiske miljøet rundt atomet. Denne variasjonen i resonansfrekvenser for en bestemte atomkjerne forårsaket av ulike elektrondistribusjoner kalles kjemisk shift. En kan dermed få informasjon om en kjernes omgivelser type kjerner som omgir denne kjernen.

Kjemisk skift blir gitt som et relativt mål i forhold til en referanse resonans frekvens. Forskjellen mellom frekvensen til signalet og referansesignalet deles på frekvensen til referansesignal for å gi kjemisk skift .

Fordeler ved NMR

• En behøver ikke lage krystaller

• Kan produsere høyoppløselige bilder av delvis eller helt ufoldede proteiner som mangler en karakteristisk 3D-struktur

Ulemper ved NMR

• Metoden er begrenset til små proteiner

• Fungerer ikke for membranproteiner

• Hvis en kjerne ikke har spinn, vil den ikke skape et magnetisk moment. Dette gjelder for kjerner med både partall antall nøytroner og protoner, for eksempel karbon-12, som er den vanligste isotopene for karbon. Karbon-13 har derimot et spinn som dermed kan brukes til å merke proteinet. Merkingen kan for eksempel gjøres ved produksjon av proteinet i et vekstmedium med mye karbon-13.

Lav-temperatur elektronmikroskopi (CryoEM)

For proteiner eller proteinkomplekser som overskrider størrelsesbegrensningen for NMR, og som samtidig vanskelig lar seg krystallisere til bruk i røntgenkrystallografi, kan det være aktuelt å benytte lav-temperatur elektronmikroskopi (CryoEM)<ref name="Lesk_cryoEM"> </ref>. Prinsippet for denne metoden er å hurtigfryse proteinene eller proteinkompleksene ved hjelp av flytende nitrogen, slik at vannløsningen inneholdende proteinstrukturen ikke får tid til å danne iskrystall-struktur (som i is og snø). Dermed beholdes også strukturen til proteinet i et (bokstavelig talt) "frosset" bilde av væske-tilstanden. Den fast-frosne protein-prøven seksjoneres så i "to-dimensjonale" segmenter, som deretter analyseres ved hjelp av elektronmikroskopi<ref name="Lesk_cryoEM"> </ref>. En tre-dimensjonal atommodell bygges så opp ved sammensetting av bilder fra de to-dimensjonale segmentene. Strukturen til virale proteinkapper er blant annet blitt bestemt ved hjelp av denne teknikken<ref name="Lesk_historie"> </ref>. Strukturen til virale proteinkapper kan man lese mer om her: Virus: Shapes and structure, life cycle.

Lav-temperatur elektronmikroskopi oppnår i seg selv ikke atomær oppløsning. Likevel, i enkelte tilfeller er det mulig å kombinere den lav-oppløselige strukturinformasjonen med atomstrukturer allerede kjent fra røntgenkrystallografi, og slik bygge opp en helhetlig atommodell for store proteiner eller proteinkomplekser som ellers ikke ville kunne blitt modellert<ref name="Lesk_cryoEM"> </ref>.

Relevans for nanoteknologi

De fleste proteiner har en aminosyrelengde på mellom 40 og 4 000<ref name="proteinstørrelse"> Bruice PY (2006). Essential Organic Chemistry. Pearson Education Inc. p. 435.</ref> (ekstreme unntak som titin har riktignok over 34 000). Dette betyr at de aller fleste proteiner befinner seg på nanometer-skala i én eller flere dimensjoner. Både kunnskap om proteiners atomstruktur i seg selv og teknologien utviklet for avdekking av disse, har således, foruten å gi generell innsikt i biologiske nanometer-skala-systemer, muliggjort mange applikasjoner innen nanoteknologi. Et lite utvalg av slike er nevnt nedenfor.

Proteinstrukturer som byggeblokker

Kjente proteinstrukturer utgjør et bibliotek av biokompatible, selv-sammenstillende og lett tilgjengelige nanostrukturer, med egenskaper perfeksjonert av evolusjon<ref name="byggeblokker"> Zheng J et al. (2007). "Nanostructure Design Using Protein Building Blocks Enhanced by Conformationally Constrained Synthetic Residues". Biochemistry 46: 1205-1218.</ref>. Dette gjør kjente proteinstrukturer til ideelle potensielle byggeblokker for blant annet bærere av antiviral medisin, plattformer for vevsreparasjon og spektroskopiske biomarkører<ref name="byggeblokker"> </ref>. Ved å introdusere syntetiske aminosyrer i peptid-kjeden kan man modifisere naturlig forekommende proteinstrukturer til å få ønsket geometri og størrelse samt ønskede interaksjonsegenskaper<ref name="byggeblokker"> </ref>. For eksempel har surfaktant-lignende proteinstrukturer blitt modifisert til å danne nanotuber og nanovaire, mens proteinet i proteinkappen til HIV1-viruset er modifisert til å danne tubulære, koniske og sfæriske strukturer<ref name="byggeblokker"> </ref>.

Legemiddel-design

Avdekking av strukturen til proteiner som inngår i sykdomsforløp kan gi hint til hvordan et legemiddel mot sykdommen bør utformes. For bekjempelse av malaria er for eksempel strukturen til proteinet PfHsp90 (Plasmodium falciparum Heat Shock Protein 90) bestemt for å finne fram til en mulig inhibitor<ref name="malaria"> Kumar R et al. (2007). "Three-dimensional Structure of Heat Shock Protein 90 from Plasmodium falciparum: Molecular Modelling Approach to Rational Drug Design Against Malaria". J. Biosci. 32: 531-536.</ref>. I andre tilfeller er det interessant å avdekke strukturen til proteiner man allerede vet har terapautiske egenskaper. Dette kan gi informasjon om den terapautiske mekanismen, noe som igjen kan gi grunnlag for modifisering av proteinet eller framstilling av analoge strukturer lignende virkemåte. En slik framgangsmåte ble brukt av Richard Pauptit et al. ved Zeneca Pharmaceuticals i 1998, der proteinene ricin og carboxypeptidase G2 ble strukturbestemt ved røntgenkrystallografi for å videreutvikle disses effektivitet ved bruk i kreft-terapi<ref name="kreft"> Pauptit et al. (1998). "Immunoconjugates as Anti-Cancer Agents". P.W. Codding (ed.), Structure-Based Drug Design 125-139.</ref>.

Protein-nanomaterial-interaksjon

Det har i nyere tid vært en økende interesse for koblinger mellom biologiske molekyler og nanomaterialer, og i forståelse, kontrollering og benytting av biomolekyl-nanomaterial-interaksjoner<ref name="interaksjon"> Kane RS, Stroock AD (2007). "Nanobiotechnology: Protein-Nanomaterial Interactions". Biotechnol. Prog. 23: 316-319.</ref>. Proteinstrukturer bundet til nanomaterialer kan eksempelvis adressere nanomaterialer til bestemte celler eller fungere som biologiske sensorer for nanoinstrumenter<ref name="interaksjon"> </ref>. Det forskes også på å benytte proteinstrukturers katalytiske egenskaper i byggeprosessen av nanomaterialer<ref name="interaksjon"> </ref>.

Kilder

<references/>